靶向重测序使高通量检测体细胞嵌合
Saumya Jamuar博士在第一个系统的、高通量的方法中使用了靶向重测序来识别大脑畸形中的罕见镶嵌突变。
靶向重测序使高通量检测体细胞嵌合
介绍
体细胞突变导致两种或两种以上具有不同基因型的细胞群，已被认为是癌症的特征。然而，虽然体细胞突变在遗传疾病中的作用已经得到承认，但它们在神经发育疾病中的患病率只是最近才被系统地评估。
传统上，遗传变异的鉴定是通过毛细管电泳（CE）/Sanger测序完成的。然而，这种迭代过程耗时、劳动密集，并且检测极限会阻止稀有变异的识别。1.新技术，如下一代测序(NGS)，使科学家能够扩大他们的研究范围，缩短发现的道路。
Saumya Jamuar医学博士，新加坡KK妇女儿童医院临床遗传学家，以及全球基因公司(一家创新的基因组研究和开发公司)的联合创始人，创造了第一个系统的、高通量的方法来识别与大脑皮层畸形相关的体细胞突变。2.他使用MiSeq系统和TruSeq Custom Amplicon分析进行了这项研究。
iccommunity采访了贾马尔博士，介绍了他的靶向重测序面板的开发，以及他如何使用NGS来改善人类健康。
问:你为什么成为一名内科医生?
Saumya Jamuar（SJ）:医学是一种职业，它能让人们以一种非常直接的方式改变他人的生活，在他们最脆弱的时候。作为一名儿科医生，我总是觉得帮助孩子很有挑战性，但在会诊结束时听到“谢谢”是非常令人满意的，尤其是当他们确实好转的时候。这种满足感和工作满足感驱动着我的整个实践。
《华尔街日报》:是什么促使你在行医之外从事科学研究?
SJ:我在新加坡学习并完成了儿科住院医师实习期，随后在哈佛医学院获得了政府资助的遗传学奖学金。在完成奖学金后，我继续留在哈佛大学，在克里斯托弗·沃尔什博士的实验室做博士后工作。这就是我从临床医生转变为临床科学家的原因。我意识到当我在诊所的时候，我一次只能帮助一个病人。然而，在实验室里，我可以通过进行影响人类健康的研究来帮助更多的病人。
我意识到翻译研究中存在着巨大的差距。转化研究没有与基础科学研究或临床试验同步进行，基础科学研究在患者护理中的应用也缺乏。我的临床医学背景和沃尔什实验室的基础研究能力为我提供了实践转化医学的绝佳机会。那时我也开始熟悉Illumina了。
“我意识到，当我在诊所时，我一次只能帮助一个病人……通过对人类健康的研究，可以帮助更多的患者。”
问：你在沃尔什实验室进行了什么样的研究？
SJ:我一直对神经疾病很感兴趣，尤其是大脑发育以及这个过程中的错误是如何导致大脑畸形的。沃尔什教授是一名神经学家，也是大脑畸形和神经精神疾病遗传学领域的领导者，所以沃尔什实验室对我来说是完美的地方。我的项目旨在开发一种系统的方法来研究大脑畸形中的体细胞突变。
问:沃尔什实验室使用Illumina的系统和产品了吗?
SJ:实验室没有投资于Illumina系统。相反，他们的测序是在核心实验室或服务实验室进行的。他们会将测序样本发送给不同的供应商，其中一些供应商使用Illumina的技术。作为我项目的背景工作的一部分，我阅读了关于不同产品的信息，其中在2012年包括Illumina TruSeq Custom Amplicon, Agilent HaloPlex，和Ion Torrent Amplicon测序等。这三款是我考虑过的，经过深思熟虑后，我决定选择TruSeq Custom Amplicon。
问:您选择TruSeq Custom Amplicon的原因是什么?
SJ:一个原因是设计实验和定制面板相对容易。当我使用DesignStudio Software测试TruSeq Custom Amplicon时，过程相当简单。我输入基因名称，并指定在外显子-内含子边界需要多少侧翼。两天后，我的设计满足了我的大部分要求。然后就是一些额外的步骤来优化面板，这也是一个简单的过程。
第二个原因是Illumina技术的声誉。在与熟悉不同技术的人交谈时，我被建议使用Illumina技术，因为它的数据质量很可靠。最后，这对我们来说很好。
“有人建议我使用Illumina的技术，因为它的数据质量非常可靠。最后，这对我们来说很好。”
问:在NGS之前的日子里，你会使用桑格测序来进行这项研究。在当时，桑格测序在鉴别变异检测中的突变方面的优势是什么?
SJ:实际上，使用Sanger测序进行变异检测并没有很多优势。这是一个漫长的过程，因为桑格测序是逐个基因进行的。有时，实验室会对许多基因进行测序，但没有任何结果。使用NGS，我们把所有感兴趣的基因放在一个面板，一个反应，然后等待结果。
此外，桑格测序对马赛克变异的检测有大约15-20%的限制。当试图检测镶嵌时，我们发现这些变异的比例可以低至5%，桑格测序将无法检测这些变异。2.使用TruSeq Custom Amplicon，我们可以很容易地检测到马赛克，基于我们的校准样品，检测下限为1%。2.与桑格测序相比，这是一个相对简单的过程。十多年来，研究人员一直试图系统地检测马赛克。使用TruSeq Custom Amplicon面板和MiSeq Reporter软件，我能够在一周内识别出这些马赛克变体。NGS使镶嵌变体检测成为一个高效的过程。
然而，这些马赛克变体的验证需要更长的时间。我们必须证明变异是真实的，而不是由于测序错误。我们使用亚克隆、单个菌落的Sanger测序来证明这一点，并花费了额外的6个月来完成。低频变异的验证仍然是一个问题，不同的实验室正在寻找验证低于30%变异的替代方法。
问：你为什么特别关注躯体镶嵌和大脑畸形？
SJ:沃尔什实验室在双重皮质素编码中发现了镶嵌现象的证据DCX导致双皮质（DC）综合征和X-连锁无脑畸形（XLIS）的基因，字面上是“平滑脑”畸形。3.患有无脑畸形的儿童通常会受到神经系统的破坏；他们可能患有癫痫、发育迟缓、喂养问题和吸入性肺炎。
大脑畸形很容易通过核磁共振等结构成像来识别。可见无脑的大脑中缺乏沟(沟)和脑回(脊)。但DC是一种谱系障碍;有些人患有癫痫，但表现相当好。他们没有发育迟缓。核磁共振成像会显示一些类似无脑畸形的变化，但不是完全的。这是由于神经元的细胞自主特性。缺乏突变的神经元会像预期的那样生长和迁移，形成正常的皮层。神经元轴承DCX突变会显示出迁移缺陷，导致正常皮层下的神经元异位带，因此被称为“双皮层”。从放射学的发现来看，大脑的镶嵌很明显，但问题仍然存在。它有多重要?这些在成像上有大脑畸形证据的家庭中，有多少家庭实际上有桑格测序所遗漏的镶嵌现象?
“使用TruSeq Custom Amplicon，我们可以很容易地检测到镶嵌，检测下限为1%……NGS将镶嵌变体检测变成了一种高效的过程。”
问:通过使用TruSeq Custom Amplicon，你们如何能够澄清一些与Sanger测序不合理的结果?
SJ:桑格检测不到一些马赛克变体，因为它们低于检测水平。其中一名患者进行了全外显子组测序，由于测序覆盖率非常低，该变异再次被遗漏。TruSeq Custom Amplicon允许至少200-500的深度测序´基因组的一个选定区域，目标是与大脑畸形有关的基因
问：是否有针对性的应用被用于研究其他神经发育障碍？
SJ:沃尔什实验室和其他实验室已经使用了靶向测序技术来检测自闭症等其他神经发育障碍的体细胞突变。4.
问:其他实验室是否使用NGS来检测不同神经系统条件下的体细胞突变?
SJ:最近有一项研究利用全基因组测序来检测导致严重智力残疾的变异。5.也有论文使用NGS显示癫痫的体细胞突变。
问：那么，你的研究为人们研究体细胞突变在这些疾病中的作用打开了一扇新的大门？
SJ:我们明确地表明，NGS是检测体细胞突变的Sanger测序的更好选择。我们在八个个体中发现了体细胞突变，其中三分之二的突变在传统的Sanger测序中缺失。其中一个人继续进行整个外显子组测序，寻找答案。但事实是，人们必须进行深度测序才能找到镶嵌突变。
我必须强调，我们不是第一个使用NGS检测体细胞突变的人。有个别病例报告，研究人员进行了全外显子组测序，发现了体细胞突变。然而，我们开发了第一种系统化、高通量的方法来鉴定体细胞突变。现在，一些临床实验室已经开始使用深度靶向测序来寻找体细胞突变。
“MiSeq Reporter让我能够检测到原本可能无法检测到的突变，不是因为数据不好，而是因为我没有使用正确的工具来校准。”
问:你为什么选择MiSeq系统?
SJ:这取决于MiSeq和HiSeq系统，HiSeq 2000系统的周转时间为14天。我想快速知道我的设计是否有问题，所以我选择了MiSeq系统，因为吞吐量在40小时内就给了我结果。我将这些库加载到系统中，第二天我就会得到结果。
鉴于现在HiSeq 4000系统的周转时间在1-3天内，它是一个提供更高吞吐量的选项。它可以使研究人员运行更多的样本。
问：MiSeq Reporter软件对你的研究有何帮助？
SJ:当我开始与NGS合作时，我知道Illumina产生了伟大的测序化学，制作了伟大的面板，但我对生物信息学的能力感到悲观。在我使用MiSeq Reporter之后，情况发生了变化。我曾尝试使用不同的算法和管道来执行我自己的生物信息学，但我没有得到我想要的答案。我决定试试MiSeq Reporter，发现这是一个快速的过程，最终我成功了。
有一个dna报告解决方案肯定会有帮助。如果你使用测序面板，你在测序仪上运行它，但这只是第一步。生物信息学很重要，但也具有挑战性。使用MiSeq Reporter的技巧是，它对目标区域执行本地化对齐。我试着自己比对FASTQ文件，但我把它们和整个基因组比对了。对于一个大的基因FLNA它编码了丝氨酸- a蛋白，但我只得到了50%的对齐，因为很多读取结果都没有正确定位，被丢弃了。当我使用MiSeq Reporter软件运行相同的数据时，我的对齐率从50%增加到了90%。MiSeq Reporter让我能够检测到突变，否则这些突变可能会被检测不到，不是因为数据不好，而是因为我没有使用正确的工具来对齐。
“NGS改变了我行医的方式。它帮助我向父母解释他们的孩子有一系列的问题，因为遗传条件，我可以识别突变，给他们一个更精确的答案。
问：现在您回到新加坡的KK妇幼医院（KKH），您是否正在使用Illumina NGS系统进行当前的研究？
SJ:回到新加坡后，我成为KKH未确诊疾病项目的临床负责人。我们正在使用HiSeq 4000系统对这些受试者进行全外显子组测序。对于综合征患者，我们使用MiSeq系统上的遗传疾病测序小组作为第一步，以确定已知基因的突变。如果这些都是阴性的，那么我们继续进行全外显子组或全基因组测序，后者我们正在HiSeq X-Ten系统上进行。
问:在你进入KKH之前，Illumina系统是否已经在那里了?还是你影响了他们的收购?
SJ:我们不拥有任何HiSeq系统，但使用我们合作伙伴拥有的系统。然而，我鼓励我们的研究实验室购买MiSeq系统，因为我以前对它有积极的经验。
问:什么是全球基因公司?
SJ:在波士顿的时候，我和哈佛大学的同事乔纳森·皮克教授共同创立了全球基因公司。我们的目标是利用基因组学了解世界上尚未开发的人口，并在亚洲市场(如印度、中国和中东)提供负担得起的和有效的基因组解决方案，以颠覆传统医疗保健，并使这些经济体能够提供精准医疗。
问：你在全球基因公司解决什么问题？
SJ:为了从精确医学和基因组学的进步中获益，我们需要将基因组学数据与临床环境联系起来，然后构建应用程序以造福最终患者。美国和欧洲有许多精密医学专家，但南亚、东南亚和中东落后于世界其他地区。结果是，科学文献中超过60%的数据来自不到1%的全球人口。例如，印度有13亿人口，公开的全基因组序列不到100个。尽管1000个基因组项目（1KGP）在印度有一定的代表性，但它们来自印度境内的特定亚群体，包括古吉拉特邦、旁遮普和锡克教，而这些只是四到五个不同的亚群体。已经证明，印度人不同于欧洲人和白种人，但在印度，来自该国不同地区的个人倾向于根据主成分分析进行隔离。
全球基因公司，连同我们的合作者，正在创建精确医学在亚洲的基础，从印度开始，然后通过定制应用将基因组学引入这些市场。
“实际上，使用桑格测序进行变异检测并没有很多优势。这是一个漫长的过程……使用NGS，我们将所有感兴趣的基因放在一个面板，一个反应中，然后等待结果。”
问:这是一项开创性的努力;你是怎么做到的?
SJ:全球基因公司专注于利用基因组学以积极的方式影响每个人的生活。这意味着为特定人群创建相关的定制应用程序，解决疾病的情感和财务成本问题。
例如，印度每年有近100万新癌症患者，2015年估计有70万人死亡。在某些类型的癌症中，例如乳腺癌和卵巢癌，每年检测到150000例新病例。印度的5年生存率为52%，而美国为89%，研究表明肿瘤药物作为一类药物的有效性较低。我们正在印度与我们在英国的合作伙伴合作开展个性化化疗，结合表型基因型和药物相互作用信息，为每个人确定最有效的治疗方案。我们还支持制药公司利用我们在基因组学方面的专业知识和这些人群中的群体，为其目标人群创造更好的、创新的、个性化的药物。
问:为什么负担能力是重点关注的领域?
SJ:我在印度长大，我非常熟悉以负担得起的方式提供产品所面临的挑战和机遇。在全球基因公司关注的市场中，虽然有相当数量的患者能够承受任何价位，但负担能力金字塔自然意味着治疗的负担能力越高，受益于这项激动人心的技术的人数就越多。因此，我们的精神核心的关键问题之一是，我们如何通过交付链使其价格合理？最终，我们的目标是创新科学的应用，创造个性化的产品，并提高成本结构的效率，以实现这一目标，使尽可能多的人受益。
“我们的目标是利用基因组学了解世界上尚未开发的人群，并在亚洲市场提供经济有效的基因组解决方案……”
问：作为一名医生，NGS对医学意味着什么？
SJ:NGS改变了我行医的方式。它帮助我向父母解释他们的孩子有一系列的问题，因为遗传条件，我可以识别突变，给他们一个更精确的答案。更重要的是，我可以告诉他们是否需要担心未来的复发风险。即使有担心的理由，我们也有办法在怀孕期间引导他们，因为我们知道突变。在NGS之前，我们不能这样做。有一个术语叫做“生育停止”，指的是在生育了患有疾病的孩子后，家庭决定不再生育孩子。如果这是一种未被诊断的分子病因的遗传疾病，它就会增加。知道分子诊断改变了一切因为现在我可以告诉父母我们可以帮助他们。
问:你如何看待使用NGS的未来?NGS将如何影响未来的医学?
SJ:我相信，当我们回首往事时，本世纪最伟大的成就将与向内看“人”和了解我们如何工作有关。我相信基因组学是我们一生中具有颠覆性的“技术”，它将使我们有权向内看，并将拼图的各个部分组合在一起。
以前，临床遗传学是关于识别一个潜在的综合症，并以预期的方式管理并发症。有了NGS，我们可以更深入地识别致病突变，并在未来可能纠正它们，让人们过上更健康的生活。
我所预见的是CRISPR和其他相关基因组编辑技术等工具的价值和实用性不断增加。地中海贫血在东南亚是一种常见的遗传性疾病，3%的人群是珠蛋白基因突变的携带者。我相信在不久的将来，我们将使用基因组编辑工具来编辑基因组，并实际治愈这种单基因疾病。显然，这是在未来，CRISPR的使用仍在发展中。如果研究人员能够优化CRISPR或其他一些基因组编辑技术，它就有可能改变医学。这就是NGS将如何从根本上改变临床遗传学的实践，这正是让我兴奋的地方。
“十多年来，研究人员一直在尝试系统地检测镶嵌现象。通过TruSeq定制放大面板和MiSeq Reporter软件，我能够在一周内识别出这些镶嵌变体。”
问:你下一步的工作是什么?
SJ:在全球基因公司，我们的计划是看看如何建立这些基因组队列，并确定潜在的新途径、药物开发和治疗的新目标。从长远来看，我们正在努力在个人层面实现个性化医疗，而不是我们现在所拥有的，这是一个适合所有人的解决方案。我们希望能够为每个人定制解决方案。
问：帮助很多人而不是一个人感觉如何？
SJ:当我作为临床医生已经在帮助病人的时候，我曾经想作为一名科学家我能做些什么。然而，科学让我可以在更大的范围内，甚至是全球范围内，帮助个人。这部分归功于Illumina制作的NGS系统，使我们能够轻松进行这类研究。当你取得成果时，科学总是更有趣，当你对病人产生积极影响时，科学总是更令人满意。
有关本文中提到的产品、系统和应用程序的更多信息：
TruSeq定制Amplicon面板，www.169o.com/products/truseq_custom_amplicon.html
米塞克系统，www.169o.com/systems/miseq.html
目标重新排序，www.169o.com/techniques/sequencing/dna-sequencing/targeted-resequencing.html
工具书类
- Gajecka M。下一代测序时代未公开的马赛克主义．摩尔麝猫基因组学. 2016;29(2):513-530.
- 王志强，王志强，王志强，等。大脑皮层畸形的体细胞突变．英国医学杂志. 2014;371(21):2038.
- Gleeson JG、Minnerath S、Kuzniecky RI等。双皮质素基因的体细胞和种系花叶突变与可变表型相关．美国人类遗传学杂志．2000; 67:574 - 581。
- 张志强，李敏，张志强，等。自闭症谱系障碍大脑的靶向DNA测序揭示了多种遗传机制．神经元．2015, 88(5): 910 - 917。
- 王志强，王志强，王志强，等。基因组测序确定严重智力残疾的主要原因．自然. 2014;511(7509):344–347.