顺应潮流:内分泌学家对NGS技术的看法
Rory Clifton Bligh博士和他的团队在悉尼大学使用MISEQ系统和TruSuq自定义扩增子检测发现遗传性内分泌癌的致病性变异体。
乘风破浪：内分泌学家对NGS技术的看法
介绍
多个内分泌肿瘤（男性）影响30,000人中的一个。1这些罕见的遗传综合征涉及至少两个内分泌腺的肿瘤（良性或恶性）。如果是癌症，它们可能会威胁生命。研究人员在理解这些和其他遗传性内分泌肿瘤综合征的遗传学基础上取得了长足的进步。在过去五年中，下一代测序（NGS）系统（如MiSeq系统）使临床研究人员能够对每个样本进行20-30个基因的多重测序，从而发现许多候选基因。
NGS技术推动了罗里·克利夫顿-布莱(Rory Clifton-Bligh)博士的研究，他在剑桥大学攻读博士期间开始研究甲状腺生长和功能的分子机制。除了繁忙的临床实践，克利夫顿-布莱博士还是悉尼大学医学副教授。他的研究团队正在使用MiSeq系统来了解内分泌肿瘤的遗传学和代谢性骨病的机制。克利夫顿-布莱博士说，到目前为止，他们已经发现了“比我们仅用传统方法估计的更多的发现”。
iccommunity采访了Clifton-Bligh博士，介绍了他的团队如何依靠Illumina技术来发现遗传内分泌疾病的病因变异和潜在的诊断和治疗靶点。
问:您实验室的研究目标是什么?
Rory Clifton-Bligh（RCB）：我们的主要研究目标是了解遗传学作为神经内分泌癌的生理学基础。这包括可遗传的癌症和可遗传的肿瘤综合征，包括多发性内分泌瘤1和2型(MEN1和MEN2)，遗传性副神经节瘤-嗜铬细胞瘤综合征(PGL/PCC)，以及一些遗传性垂体疾病。我们实验室还研究非遗传性肿瘤的肿瘤生物学，如甲状腺癌和肾上腺癌。我们隶属于柯林医学研究所(Kolling Institute of Medical Research)的癌症部门，在这里我们可以获取大量散发性和家族性内分泌肿瘤样本，这些样本已经储存了几十年，具有合理的临床注释。
问：你可以通过研究内分泌疾病的遗yobet亚洲传基础来学习什么？
RCB:研究内分泌疾病的遗传基础使我们能够在最基本的水平上了解这些肿瘤的基因组紊乱。例如，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤相对少见，但它们是已知的最具有高度遗传性的肿瘤。事实上，高达40%的肿瘤患者携带遗传易感性的种系变异。
通过了解初始遗传侮辱是什么，我们可以遵循向肿瘤发展的道路进行前进，并沿途理解步骤。我们已经确定了内分泌疾病的诊断和治疗有用的目标。
问:NGS和其他技术是如何推动这些进步的?
RCB:随着越来越多的基因被NGS发现，这已经成为一个发展非常迅速的领域。仅在过去的5年里，NGS(包括RNA-Seq)、DNA甲基化分析、CNV阵列和质谱技术推动了肿瘤生物学新时代的主要进展。我们觉得我们现在正在遗传内分泌肿瘤的发现浪潮中冲浪。这是一个疯狂的旅程，非常令人兴奋。
“仅在过去5年，肿瘤生物学新时代的主要进展都是由NGS(包括RNA-Seq)、DNA甲基化分析、CNV阵列和质谱技术推动的。”
问:NGS让你发现了哪些使用老技术看不到的东西?
RCB:NGS使我们能够以多种方式发现变体。我们的情况是基因异质性的，所以我们需要评估每个样本中的多个基因。这个耗时的过程增加了假阴性结果的概率。有了NGS，我们就有能力在单个分析中同时对多个样本中的大量基因进行测序。
我们还对某些内分泌肿瘤综合征的基因失活是否可能通过合子后嵌合发生感兴趣。为此，NGS带来的优势是能够执行600的超tradep测序´和更高，使用MiSeq系统和TruSeq定制Amplicon分析。
我们可以接触到柯林研究所的大量藏品，这些藏品涵盖了20-30年来自患病家庭的遗传性内分泌肿瘤样本。以前的技术方法往往不能提供答案，这些样本的基因发生了什么。我们正在用NGS对这个组织库的样本进行测序，逐步发现致病变异。这是令人兴奋的。
问:MiSeq系统对你的学习有什么帮助?
RCB:我们正在使用Truseq自定义扩增子在MISEQ系统上开发20个或更多基因的自定义扩增子面板。MISEQ系统快速，高效，使我们能够执行超级测序，这对我们的研究成功至关重要。
我们有使用其他测序系统进行研究的经验，但MiSeq系统是最适合我们实验室的。当我们四年前获得它时，我们担心波动性和潜在的污染问题，并正在寻找一个系统，从设计的角度来看，将会限制组织样本之间交叉污染的可能性。我们认为MiSeq系统在这方面表现最好。
“TruSeq Custom Amplicon Assay工作得很好，我们对化学、读数和生物信息学处理很满意。”
问：您是否使用过DesignStudio软件以准备您的Truseq自定义扩增子面板？
RCB:DesignStudio很容易用于准备我们的定制放大器面板，更重要的是，它工作得很好，是健壮的。它很好地涵盖了我们目前所研究的大部分基因。
问：您喜欢TruSeq定制扩增子分析的哪些方面？
RCB:TruSeq Custom Amplicon Assay工作得很好，我们对化学、读数和生物信息学处理很满意。创建自定义扩增子分析是一个迭代过程，我们已经创建了各种自定义设计，添加新的基因，有时稍微调整设计。我们对TruSeq Amplicon-Cancer小组的经验有限，主要是因为我们从自己的定制设计中获得了如此好的结果。TruSeq Amplicon-Cancer小组最近进行了更新，这是一种我们可以在未来再次使用的方法。
问：在进行这些研究时，您面临哪些生物信息学挑战？
RCB:总的来说，MISEQ系统在捕获低悬垂的水果时一直是非凡的。扩增子测序中的初学者的陷阱忘记了每个样本的每个扩增子都均匀覆盖。要考虑到这一点，我们的生物信息学处理包括一种允许我们查看任何单独样本的算法，每个样本都在运行中覆盖的内容。
我们仍在研究如何最好地使用NGS和生物信息学处理来检测更大的缺失。我们已经能够检测到高达26 bp的缺失，可能有1%的病例是由于更大的缺失(全外显子缺失或全基因缺失)导致基因失活的。我们的生物信息学处理还没有达到检测这些大缺失的标准，因此我们仍然依赖于多重连接依赖的探针扩增(MLPA)。
我们与一家研究所合作，最近收购了Hiseq x十个系统，我们有兴趣知道这种强大仪器上的基因组覆盖是否可以可靠地检测大缺失。我们正在建立一个研究设计来看待该问题。
MiSeq系统快速、高效，使我们能够进行超深层测序，这对我们的研究成功至关重要。”
问:你们用什么来进行生物信息学处理?
RCB:我们不是生物信息学实验室，所以我们选择易于使用的软件工具。我们使用MiSeq Reporter进行对齐和变量调用，然后使用Annovar对变量进行注释。我们使用了一些内部算法，但是MiSeq Reporter对于我们的目的来说非常健壮。整合基因组查看器（IGV）也是用户友好的，我们使用它一个接一个地可视化数据放大器。
问：你一次排序有多少个样品？
RCB:我们每次运行运行48-96个样本。我们不少于那个，因为它不具有成本效益。我们略微谨慎，因为每个样本都有很高的概率含有致病变体，我们必须在其优点上解释每个样本。鉴于我们的自定义扩增子面板由20-30个基因组成，我们序列48-96每次运行的样本超过1000´．正如我们的合作者经常告诉我们的，我们经常使用保时捷在当地购物。我们的报道深度太大了，但符合我们的需要。
问：您是否使用MISEQ系统序列FFPE样本？
RCB:我们已经成功地对FFPE DNA样本进行了测序。MiSeq系统是对FFPE样本进行测序的一种很有前途的工具，可在单次分析中获得更大范围基因的良好覆盖率。
问：您的实验室将MISEQ系统纳入其工作流程的速度有多快？
RCB:我们从对NGS一无所知到在2-3次测序过程中成功运行MiSeq系统。易用性是MiSeq系统的一个优势，也是我们选择它的原因之一。我们喜欢这种化学反应，而且很直接。
“这是用MiSeq系统将一年的测序工作压缩到一周的结果。”
问：你们用MiSeq系统对放大器面板进行测序的周转时间是多少？
RCB:预备图书馆需要大约两天时间来加载系统;然后，测序，对齐和变体调用然后需要〜27小时（全部在MISEQ系统上执行）。可以在1-2小时内执行变体调用的注释。注释产出的解释通常需要我们大约一周。
因此，使用MiSeq系统，我们的综合小组需要大约10天的处理时间来询问48-96个样本中的20个不同的基因。我们进行了大量的桑格测序，这将花费我们一年多的时间来一个一个地测序这么多样本。这是用MiSeq系统将一年的测序工作压缩到一周的结果。在科学领域，这种生产力的飞跃是很少见的。这是惊人的。
yobet亚洲亚博官网人口了解本文中提到的Illumina产品和系统的更多信息:
米塞克系统，www.169o.com/systems/miseq.html
TruSeq自定义扩增子分析，www.169o.com/products/treuseq_custom_amplicon.html.
设计工作室软件，www.169o.com/informatics/research/experishing-design/designstudio.html.
TruSeq Amplicon-Cancer面板,www.169o.com/products/treuseq_amplicon_cancer_panel.html.
HiSeq X Ten系统，www.169o.com/systems/hiseq-x- sequencing-ystem.html.
MiSeq Reporter软件，www.169o.com/systems/miseq/software/miseq-reporter.html
参考文献
- 内分泌和神经内分泌肿瘤的遗传学-为卫生专业人员(PDQ)。国家癌症研究所。www.cancer.gov/types/thyroid/hp/medullary-thyroid-genetics-pdq.. 2015年10月15日查阅。