研究人员从旧的艾滋病毒过度研究的新技术转变为新技术
MiSeQ系统功能，包括易用性，排序深度和高灵敏度，使研究人员能够匹配或超过使用Roche 454系统获得的结果。
研究人员从旧的艾滋病毒过度研究的新技术转变为新技术
介绍
Jacques Izopet博士和Stéphanie Raymond博士在法国图卢兹的Université Paul Sabatier研究HIV的嗜性(边栏)以及它在感染进程中如何变化。在过去的10年里，他们使用了各种表型和基因型方法来评估HIV是如何通过共受体进入细胞的。2010年，他们在罗氏454系统上开发了下一代测序(NGS)方法，用于评估HIV 1型(HIV-1)辅受体的使用。随后，罗氏宣布454系统停产，试剂将很快停产。
该团队致力于确定一个新的NGS平台。他们选择了MiSeq系统，并开始了比较研究，专注于深度测序敏感性、共受体评估数据和总体性能。1
我的社区采访了博士。Izopet和Raymond来了解他们如何评yobet亚洲估MiSeq系统上的HIV-1倾向检测方法以及他们获得的结果。
Jacques Izopet博士是病毒学实验室的主任，Stéphanie Raymond博士是病毒学系的研究员Université Paul Sabatier在法国图卢兹。
问：HIV-1的热情如何确定？
StéphanieRaymond（SR）：HIV-1共受体使用的主要基因型决定因素是基于gp120包膜糖蛋白的第三个变量环(V3)的测序。我们开发了从V3氨基酸序列预测HIV-1辅助受体使用的算法。
Jacques Izopet（JI）：我们还开发了一种表型方法，Toulouse Rocism Test（TTT），用于确定病毒进入细胞的机制。TTT使用逆转录-PCR（RT-PCR）来扩增使用从等离子体样品中分离的RNA编码GP120 EV基因的片段。该产品用于产生表达攻击性env基因的重组病毒颗粒。然后将这些颗粒释放到上清液中以感染轴承CD4的U87指示细胞并表达CCR5或CXCR4（侧边杆）。
hiv - 1主机取向
向宿主性是指病毒通过结合特定的共受体而感染特定宿主细胞的能力。HIV-1通过一个或两个宿主细胞趋化因子共受体CCR5和CXCR4进入表达cd4的细胞。使用这些共受体之一的病毒株分别被称为R5变种或X4变种。同时使用两种共受体的菌株被称为双混合变异(D/M)。在HIV感染初期，HIV-1病毒利用CCR5进入。在疾病的后期阶段，病毒转换到CXCR4进入宿主细胞。
努力开发靶向团簇并阻止病毒进入的分子。例如，Maraviroc是一种CCR5团体拮抗剂，其通过与CCR5受体结合来防止HIV-1进入靶细胞。为了有效地使用此和其他CCR5激动剂药物，必须准确地确定HIV-1控制器使用，因为未检测到的次要CXCR4使用变体的存在会导致随后的病毒故障。2
问：基因型HIV-1对热性研究如何与TTT表型进入测定进行比较？
SR：虽然重组病毒表型测定，例如TTT，被认为是用于测定HIV-1的GOV-1的金标准，但它们的常规用途受到高成本和长期周转时间的阻碍。相比之下，NGS基因型HIV-1的热衷试验简单，快速，便宜。然而，基因型试验通常在确定艾滋病毒的非洲亚型的覆身性能方面具有差的性能。
吉：V3 env区域的超深测序允许像表型方法一样检测低水平的CXCR4变异。
问：您如何在Roche 454系统上验证您的HIV-1覆身分析方法？
吉：2010年，我们使用roche 454 gs-unior系统来序列HIV-1 V3 ENV区域。为了验证系统，我们严重依赖于我们的TTT表型细胞试验。我们获得的一致性很好，并使我们能够建立解释算法。这些算法成为专门用于解释HIV-1热化NGS数据的Pyrovir软件的基础。
“MISEQ系统的排序速度使得能够处理更多的样本。”
问：如何促使您考虑其他NGS系统进行HIV-1的抗染性分析？
吉：当罗氏454技术的结束时宣布，我们认识到测试其他NGS技术的重要性。它与罗氏454试剂不再可用的消息变得不可避免。我们引导了对MISEQ系统的关注。
问：你是如何进行比较研究的？
SR：利用来自抗逆转录病毒naïve研究对象的52份血浆样本，我们比较了MiSeq和Roche 454平台上的深度测序数据。我们使用我们的算法来解释来自每个系统的NGS数据，并确定HIV-1辅受体的使用。TTT作为参比分析。我们还验证了检测X4病毒的敏感性参数和定量这些变异的线性参数，使用20个病毒克隆。
问：你的比较研究结果是什么？
SR：MiSeq系统在检测微小的X4变异方面很敏感，并且与TTT金标准检测HIV-1的趋向性密切相关。MiSeq和Roche 454系统检测微小CXCR4-using变异的灵敏度相似:MiSeq系统为5000 reads的灵敏度为0.26%，Roche 454系统为2000 reads的灵敏度为0.25%。
在确定量化次要X4变体的灵敏度时，MISEQ系统比罗氏454系统（1-5％）更敏感（0.5-1％），可能是因为使用MISEQ系统获得了更多读取。
两种NGS方法在对52个临床样本的分析中90%的结果一致，类似于两种表型方法预测HIV-1趋向性的一致性。两种NGS测定方法与TTT的一致性均高于70%。
“MISEQ系统被证明对检测次要X4变体进行敏感，并且与测定HIV-1的TTT金标准良好相关。“
问：可以对整个HIV-1包络进行排序，提高HIV-1覆革主义预测吗？
SR：我们有一些声音争论，即当前在V3 Env区域中识别的热感的决定因素不足以获得最佳预测。我们认为，病毒包络的其他区域涉及使用毒群进行病毒进入。
吉：与基因型测定相反，TTT测定使用完整的包膜序列。新一代测序系统允许对完整的HIV-1包膜进行测序，以及基于其他区域分析的新算法，将改进对HIV-1辅受体使用的基因型预测。
目标是提高灵敏度，包括各种亚型。Subtype B是美洲，西欧和澳大利亚的主要亚型。与参考测试相比，测序亚型B的整个HIV-1包络提供更好的灵敏度，用于识别X4病毒。它还将以更可靠的方式确定非洲亚型的热衷。
问：特定病毒亚型的验证基因型算法的值是多少？
SR：必须具有适合于病毒亚型的预测算法。从NGS获得的原始数据仍然需要分析以预测病毒性的覆革主义。多年来，我们的目标是开发预测算法，该预测算法考虑了病毒亚型之间的Tropisim差异。已经为最常见的HIV亚型开发了特定的算法，但为所有HIV亚型创建它们是很重要的。
问:与罗氏454相比，MiSeq系统的工作流程如何?
SR：MiSeq系统的样品制备步骤比Roche 454的制备步骤简单。由于操作较少，MiSeq系统运行之间的可变性也较小。罗氏454系统需要更有经验的技术人员。珠的分布质量和试剂的灵敏度存在问题。
“对于能力和成本，Miseq系统完美适合我们。”
问:MiSeq系统在病毒学研究方面有什么优势?
吉：MISEQ系统的排序速度使得能够处理更多数量的样本。对于核心实验室，需要优化每次运行的样本数以获得所需数量的读数。每个用户都可以确定每个系列的样本数量和分析深度。MiSeq流量电池提供这种灵活性，可以在实验室中调整。对于能力和成本，Miseq系统非常适合我们。
问:你下一步的学习计划是什么?
吉：下一步是使用MiSeq系统获得准确的病毒种群定量，特别是使用CXCR4的病毒种群。通过最小的优化，我们已经有了良好的一致性。我们相信很快会有一个满意的结果。