寻找细菌耐药性的来源

介绍

结核病(TB)通常被认为是一种过去的疾病。然而，这种曾经被称为“痨病”的潜在致命疾病仍然是全球十大致死原因之一。根据世界卫生组织(世卫组织)的数据，2017年有1000万人被诊断出患有结核病。600万人死于这种疾病。¹它目前的优势部分来自于这种细菌的进化能力，即使在面对四种特定抗菌药物为期六个月的治疗方案时也是如此。这种治疗已经使用了几十年，随着时间的推移，许多结核菌株甚至对曾经有效的一线药物如异烟肼和利福平产生了耐药性。2017年，有50多万新的结核病病例对利福平或异烟肼和利福平都有耐药性，表现出多药耐药性，使这种疾病更难治疗，也更有可能传播。²早期发现结核暴发和有效识别新的耐多药结核菌株已成为防治该疾病的关键。

菲利普供应，博士，法国国家科学研究中心（CNRS）的高级科学家和研究主任在Actitut de Lille的感染和免疫中心，他的大部分职业生涯都在研究细菌的内部工作导致结核病，结核分枝杆菌．作为genscreen(一家法国生物技术公司，提供最先进的测序和基因组分析服务)的科学顾问，Supply博士协助开发了一种新的靶向深度测序分析，Deeplex Myc-TB。该检测方法灵敏、准确，可以直接从临床痰标本中识别耐药结核菌株，而不需要费时的细菌培养。

iccommunity与Supply博士讨论了日益严重的耐多药结核病问题、Illumina下一代测序(NGS)系统对其检测的价值、Deeplex Myc-TB分析的开发，以及如何使用它来检测耐多药结核病菌株和限制隐性疫情。

Philip Supply，Phd是Institut Pasteur de Lille的感染和免疫中心CNR的高级科学家和研究主任，并在GeinoScreen的科学顾问。

问:是什么激发了你对结核病的细菌基因组学和分子流行病学的兴趣?

菲利普供应(PS):在我职业生涯的早期，我研究了与酵母遗传学相关的非常基本的问题。我想改变和研究一些直接造福于公众的东西。我联系了法国北部里尔巴斯德研究所的实验室负责人，他建议我研究结核病。里尔巴斯德研究所是最初的抗结核疫苗，卡介苗(BCG)，一个世纪前被开发出来的地方，所以这里有广泛的结核病研究历史。在这次谈话中，我了解到很多关于当今结核病问题的严重程度yobet亚洲。

问：为什么TB一直很难根除？

PS.结核病是一种悄无声息地传播的传染病。在确诊之前，患者可以在相当长一段时间内没有明确的结核感染临床症状。因此，能够正确诊断这种疾病并追踪其传播非常重要。然而，由于该细菌的特性，包括其高度无性系的群体结构，很难追踪结核在群体中的传播。结核病毒株之间的低多样性导致需要非常精确的分子工具来追踪毒株及其在人群中的传播。获得的数据可以用来识别结核病患者和他们接触过的所有人，以及确定流行菌株的传播，以描述爆发情况。

问：目前结核病是如何治疗的？

PS.：与其他细菌感染相比，TB非常难以治疗，并且需要一个非常苛刻的治疗方案。最简单的课程需要六个月，仅作用于患者的TB菌株易受当前的一线抗生素的影响。在这个方案中，结核病患者每天服用四种药物持续两个月。在接下来的四个月中，他们需要继续服用这四种药物中的两种药物以确保治愈。

不幸的是，我们已经使用这些一线药物相当长的一段时间了，耐药菌株已经出现。患有耐药菌株的患者面临更长、甚至更复杂的治疗方案。这些患者的治疗可能需要两年时间，使用5-7种不同的药物，效率较低，副作用较多。这会影响治疗的成功率和死亡率。

世卫组织估计，每年大约有50万名新患者患有利福平耐药结核病或耐多药结核病。然而，这些患者中只有25%的人被确诊并得到相应治疗。这种诊断差距是一个巨大的问题。²

“DEEPLYPLYC-TB测定可以直接施用于从临床样品中提取的DNA，细菌载量最小，减轻了培养和加速分析的需要。”

问：医生如何知道他们是否正在处理疾病的抗性菌株？

PS.：鉴定耐药TB菌株的古典方式是从受感染的患者收集痰，种植培养物中的样品，并测试所得分离物以进行抗生素敏感性。如果该菌株与第一线TB药物耐药，如异噻唑和利福平，则进行另外的培养物以在第二线药物存在下进行生长。这种方法的困难是这些细菌生长得非常缓慢。在完成完全诊断之前可能需要两个月。

问：是否有新药可用于打击MDR-TB？

PS.：在过去的几年里，一些新药已发布，在治疗MDR-TB方面提供了重大进展。Bedaquiline于2012年被批准。不幸的是，我们已经看到了抵抗它的抵抗。Delamanid于2014年获得批准，弗吉曼德在美国的监管审查中。

问:Deeplex Myc-TB试验如何识别结核耐药菌株?

PS.与全基因组测序(WGS)相比，Deeplex Myc-TB是一种靶向的基于ngs的检测方法。虽然WGS分析可以提供结核病菌株中发生的所有突变的全面图像，但进行分析所需的大量DNA是一个问题。结核菌培养需要7-10天才能获得足够数量的DNA用于WGS测定。这是一个显著的限制，可能会延迟耐药结核菌株的鉴定。

我们转向了一种靶向测序方法，在测序之前，我们首先扩增结核杆菌的主要耐药基因靶点。Deeplex Myc TB分析可直接应用于从临床样本中提取的DNA，且细菌负载量最小，从而减少了培养和加速分析的需要。

除了速度，靶向测序方法的另一个好处是测序的深度。深度测序很重要，因为它使研究人员能够自信地捕捉携带耐药突变菌株的可能亚群。即使这些亚群只占细菌总数的一小部分，它们也会导致患者产生耐药性，因为它们会被选择接受治疗。Deeplex Myc-TB试验可以检测到一个携带耐药突变的细菌亚群，该突变只占样本的3%。

DeePlex Myc-TB测定成功的另一个关键方面是，我们成功开发了一个完全参数化和自动的Web应用程序，以便快速，轻松地分析和解释测序结果。这使得该测定容易访问不是NGS专家的许多用户。

图1：Deeplex MyC-TB测定基因靶标包括用于检测已知（红色）和潜在（蓝色）抗TB药物抗性相关突变的标记物。

问:你们是如何选择Deeplex Myc-TB试验中使用的标记物的?

PS.：我们的标记物选择是基于我们之前对肿瘤耐药主要靶点的了解结核分枝杆菌．我们定义了一个包含18个基因的标记集，并包括了这些基因中已知的耐药突变(图1)。

这种分析方法可以很容易地扩大规模。我们计划增加标记物的数量，包括最近释放的药物的靶点，如delamanid和pretomanid。

问：Deeplex Myc-TB测定是否未覆盖MDR-TB菌株？

PS.：我们对来自四个南非省份的TB阳性培养物进行了研究，其中1823个TB分离株仅使用电流分子技术的异度抗性鉴定，例如Genexpert MTB-RIF测定和线探针测定。^3.我们随机选择其中277个分离物并用利福平抗性突变特异性测定筛选，然后使用MISEQ系统进行Deeplex MyC-TB测定和WGS，以评估广泛的电阻，传动和演化模式。在15％的测试样品中，我们鉴定了一种特殊的突变，导致利福平的抗性在当前的世卫组织批准的分子试验或其他测试中捕获。此外，我们鉴定了导致异噻唑和两种其他一线药物抗性的突变，从而将分离物重新分类为对所有第一线抗生素的MDR-TB菌株。

我们还发现，这些菌株中的大多数是同一次暴发的一部分。结果，这些菌株在该国逃避了耐多药监测。我们还在六个分离株中发现了四个不同的突变，这些突变可能与贝达喹啉敏感性降低有关。这完全出乎意料。这些患者本不应该用这种药物治疗，但我们在患者群体中看到了可能出现的耐药性迹象。

问:贝达奎林的耐药性怎么会发展得这么快?

PS.：这是一个微妙的问题，在这个特定的情况下，我们还没有明确的答案。我们的系统发育分析结果表明，这些突变在该国的临床访问程序开始后出现了贝壳 - 结核病患者的临床访问程序。与此同时，我们知道Bedaquiline和较早的抗结核病药物之间可以存在横向性。与Bedaquiiline抗性相关的主要基因也是与氯氟氮亚胺抗性相关的主要基因。其他数据可能会讲述我们发现的突变是否反映了这种交叉抑制或可能滥用新药。

＂...Illumina公司门店系统……在检测突变方面也具有很高的准确性。这非常重要，因为我们需要能够检测到样本中携带耐药性突变的少数结核病人群。”

问：Deeplex Myc-TB测定如何识别旧技术不能造成的突变？

PS.：Deeplex Myc-TB测定提供多于经典分子方法。它更全面，因为它放大了> 10,000个碱基对，包括主结核病耐药靶标。它涵盖了13种抗结核病药物或药物类别的耐药相关突变。目前的技术，包括Genexpert MTB-RIF和线路探针测定，不能匹配。

GeneXpert的MTB-RIF检测是基于实时PCR的，而且速度很快，只需要两个小时就能得出结果。然而，它只覆盖了有限的区域rpoB基因，这是一个热点突变导致利福平耐药。这就是为什么它没有识别新的南非耐利福平菌株。这些菌株携带的突变在这个区域之外rpoB．此外，Genexpert MTB-RIF测定仅检测利福平抗性，并且不提供关于任何其他抗TB抗生素的抗性的信息。

在线探针检测使用PCR和杂交在线探针。这些探针只包含一些，但不是所有抗结核药物的一组有限的常见耐药性突变。

牛津纳米孔系统采用WGS，捕捉到更多的目标，代表了一项更为近期的测试。如前所述，WGS分析需要培养步骤以获得足够的DNA量。因此，系统速度较慢，覆盖深度通常较低。据我们所知，与Illumina NGS系统相比，测序的准确度没有那么高。这是一个很大的限制，特别是在检测少数民族群体中的突变时。

问：国际组织是否使用Deeplex Myc-TB测定？

PS.世界卫生组织正在使用我们的检测方法进行结核病耐药性调查，该组织的2018年技术指南中提到了这一点。^4.一些调查数据已经发布，其中包括涉及数据挖掘Djibouti中的TB毒性水平的数据。在吉布提中没有系统地进行培养。结果，Deeplex Myc-Tb测定特别有用，因为测定可以直接在没有所需培养的临床样品上运行。除了吉布提MDR-TB监测调查外，谁正在使用我们的测定在其他国家的TB药物抵抗力调查。

“在不久的将来，我设想世界卫生组织和许多其他卫生机构将大规模使用基于NGS的靶向和WGS分析。”

问：是否已将Deeplex Myc-TB测定列入世卫组织技术指南，这导致使用NGS测定的监测使用NGS测定增加卫生机构的增加？

PS.：它增加了我们的测定对监视的使用，以及对个体患者的TB耐药性的快速诊断。监测提供了一种准确的Tb流行病学图片，即患者的含量和耐药性在总人口中，并且基于NGS的测定可以在这里产生显着差异。WGS和靶向NGS测定可以提供关于患者群体中耐药性患病率的广泛数据，基于从单个患者的分离物获得的基因型信息。

作为一种靶向分析，一旦获得临床样本，Deeplex Myc TB也可以在近实时条件下应用。这种分析方法可以为快速临床决定患者最合适的治疗提供相关信息。相比之下，WGS分析具有在全基因组水平上精确确定分离物遗传相关性的优势。因此，它还可以提供关于人群中是否存在暴发菌株的宝贵信息。在不久的将来，我设想世界卫生组织和许多其他卫生机构将大规模使用基于NGS的有针对性和WGS分析。

问：为什么你和Geoxcreen团队选择illumina ngs系统进行测定？

PS.我们与Illumina的NGS系统合作，包括MiSeq、NextSeq 500、MiniSeq和iSeq 100系统，因为它们是全球使用最多的。如果我们在这些平台上开发并验证这种分析方法，它将给我们带来一个重要的优势，因为它将有利于更快速、更有效地推出这种分析方法。这些平台还以提供检测突变的高精度而闻名。这是非常重要的，因为我们需要能够在样本中发现携带耐药性突变的少数结核病人群。

问：您是否认为Deeplex Myc-TB测定在发展中国家的TB监视和其他类型的医疗工作中有用？

PS.：我们希望Deeplex Myc-TB测定将成为全球使用的宝贵工具。除了在一些欧洲中心的目前使用外，该检验将部署在两个非洲国家，贝宁和卢旺达。明年初，我们将启动一个项目来临床上评估其他发展中国家的检验。评估将与创新新诊断的基础合作进行（查找）。亚博下载app查找由Unitaid获得的授权专门用于测试低收入和中等收入国家的TB诊断的新目标NGS工具。亚博下载app

问:要使基于ngs的结核检测方法广泛用于结核监测和诊断，必须克服哪些挑战?亚博下载app

PS.我们需要在发展不同国家的分子生物学基础设施和技术方面取得进展。装备和培训将使用基于ngs的Deeplex Myc-TB分析的结核病参考中心和实验室可能比建立基于细菌培养的分析能力更容易。事实上，后者需要特殊的生物安全基础设施，而可直接应用于临床样本的试验并不需要这些基础设施。我们已经组织了现场培训，审查Deeplex Myc-TB检测工作流程的技术步骤。这将确保该分析被很好地接受和最有效地使用。

另一个焦点领域将根据不同突变的检测培训关于测定数据解释的员工。为了促进数据解释，我们的Web应用程序对测序数据的自动分析具有非常用户友好的设计。

问：Deeplex Myc-TB测定的开发中的下一步是什么？

PS.除了在Deeplex Myc-TB试验中添加新的靶点以检测对最新结核病抗菌药物的耐药性外，我们还设想将该试验扩展到其他分枝杆菌。我们有一个原型测试麻风分枝杆菌，引起麻风病的分枝杆菌。与结核病不同的是，许多人认为麻风病是一种过去的疾病。虽然这种情况并不常见，但它仍然存在于世界某些地区，包括非洲、巴西、印度和中国。麻风病检测的原型检测耐药性，并确定用于诊断和监测的基因型菌株。虽然它不能覆盖整个基因组，但这种有针对性的分析可以区分菌株亚系和在患者群体中传播的药物敏感或耐药菌株。

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