目标基因测序面板启用快,发现具有成本效益的变体

介绍

佛朗哥电路,MD,正面神经退行性和代谢疾病的遗传单位卡洛Besta神经研究所(INCB)在米兰,他的团队研究代谢和神经紊乱。25年了,他们Sanger测序用于研究定义罕见的神经退行性疾病的分子基础,如小脑性共济失调,痉挛性下肢瘫痪和遗传性疾病。三年前,他的团队从桑格转向针对下一代测序(上天)MiSeq系统,使用不同的有针对性的基因发展中一个独特的工作流程面板来识别潜在的与这些神经退行性疾病相关的遗传变异。

总会使电路研究博士的小组确定变异的一小部分时间和成本显著低于Sanger测序。2016年,研究小组发现小说突变导致疾病,腓骨肌萎缩影响周围神经遗传性神经系统障碍。^{1 - 3}他们也能屏幕许多科目与小脑性共济失调,以识别巨大基因的突变SYNE1。⁴电路研究博士的研究小组有几个论文审查关注小说变异的发现与脑白质病变和周围神经病变。

iCommunity博士与电路对他使用基因测序目标板在他的研究中,如何MiSeq系统扩大和加速他的研究工作。

佛朗哥电路,MD,正面神经退行性和代谢疾病的遗传单位卡洛Besta神经研究所(INCB)在米兰,意大利。

问:关于神经和代谢疾病首先感兴趣你什么?

佛朗哥电路(英尺):我在医学院培训成为一个神经科专家。当我开始工作的实验室在1980年代早期,我专注于神经和代谢的生化和代谢方面的疾病。解决困难的问题,这些疾病目前是一个激动人心的挑战。

问:什么是卡洛Besta神经学研究所的使命?

英国《金融时报》:研究所的研究主要集中在儿童和成人神经和代谢紊乱。我们看到罕见的遗传疾病,我们试图破译的例子使用测序识别新变体。

问:你的团队的研究焦点是什么?

英国《金融时报》:我们的团队有一个长期的兴趣和专长脊髓小脑的共济失调,小脑和疾病的传入和传出通路,导致运动障碍。这些疾病不同于帕金森病,因为除了地震之外,还有一个缺乏协调的运动。

我们也关注痉挛性下肢瘫痪,这是一个障碍的皮质脊髓的运动路径,和周围神经髓鞘髓鞘形成障碍,影响中枢神经系统。神经系统疾病的特点是异构的遗传病因,往往与50多个基因负责每个条件。例如,对于一个主题呈现的小脑功能障碍我们怀疑有遗传性疾病,可能有超过80种不同的基因原因负责条件。

问:你的实验室利用Sanger测序了多长时间?

英国《金融时报》:我们在1989年开始使用Sanger测序和转换到使用门店三年前当我们获得MiSeq系统。

问:是什么促使你从Sanger测序过渡到门店?

英国《金融时报》:神经系统和代谢疾病的异质性导致我们考虑使用门店在我们的研究中。90 - 100基因有助于我们学习疾病的表型。桑格测序,我们只能测试一次7 - 12基因。利用Sanger测序分析80个基因不是负担得起的。

捷的方法使我们能够分析同时许多基因和成本效益,帮助我们了解这些疾病的复杂性。我们现在使用Sanger测序验证变异识别使用门店。

“门店,需要大约两天分析一个主题样本200个基因。如果我们使用桑格测序,它可能需要几个月来完成同样的分析。”

问:你为什么选择执行目标基因面板测试而不是全基因组或外显子组研究?

英国《金融时报》:第一种方法,全基因组测序(WGS)研究是昂贵的对我们和角度复杂。whole-exome测序的附加费用(韦斯)不是必要的,因为我们的首要任务是让一组感兴趣的基因的几乎100%的覆盖率。我们选择创建五个目标排序面板不同的疾病,包括共济失调和痉挛性截瘫,神经病,脑白质营养不良(中央髓障碍),肌萎缩性脊髓侧索硬化症,癫痫。除了便宜,有针对性的基因面板测试消除偶然发现的复杂的问题。

问:什么是NGS-based针对性测序工作流用来识别与神经学和代谢疾病相关的变异?

英国《金融时报》:我们的门店工作流程是基于MiSeq系统,它可以处理12到24主题每运行样本。我们开始用便宜的,小试销面板和转向更大,目标基因面板在必要的时候。这取决于我们的基因数量目标,我们使用Nextera®XT DNA或Nextera快速捕捉定制浓缩库准备包准备样品的基因面板。

首先,我们屏幕样品与几个最常见的基因突变的障碍表现。我们捕捉25 - 35%的致病性变异与这个目标屏幕。基因集根据不同疾病或表型分析我们感兴趣。例如,共济失调科目一般有4 - 6常见基因,而这些是我们首先屏幕。对于这些狭窄的目标基因面板,我们使用Nextera XT DNA库准备装备准备样品和创建扩增子库。

如果这些基因的屏幕是负的,我们网撒得更大,执行第二轮针对性与基因测序面板。每个小组由几乎所有与特定疾病相关的基因(70 - 200 /面板)的基因。例如,一个小组为共济失调包括所有已知的基因引起共济失调为主要症状。脑白质营养不良面板包括所有的基因导致中枢神经系统脱髓鞘,等等。对于这些基因面板广泛的目标,我们使用Nextera快速捕获定义浓缩设备。这个工具是很有用的,尤其是当这个主题的连续性与许多基因表型。例如,共济失调的人可能也有痉挛性截瘫特性,反之亦然。有一个面板,这是一个优势,而非两个单独的面板测试各种疾病的基因。Nextera快速获取定制的浓缩,我们还可以分析拷贝数变异,使我们能够确定删除或重复,可能会导致疾病。

如果我们不确定疾病的存在变异使用疾病面板,我们求助于外显子组测序将感兴趣的一个更广泛的网络来识别变异。

”根据基因的数量目标,我们使用Nextera XT DNA或Nextera快速捕捉定制浓缩库准备包准备样品的基因板。”

问:你如何把新基因融入你的电池板?

英国《金融时报》:我们的板是定期重新设计。每一次我们再订购他们,我们有机会增加新的基因,我们和其他人来说,可能在我们的研究已经确定了。虽然Nextera快速捕捉定制浓缩设备允许许多基因,我们有时必须拿出一些基因,为新的。

问:你为什么选择MiSeq系统执行目标重测序研究?

英国《金融时报》:我们选择了MiSeq系统基于我们的预算及其可靠性的数据质量,特别是在测序通过长时间的重复基地。的速度和系统的通用性也考虑我们的决定。

问:你如何分析数据?

英国《金融时报》:数据分析始于VariantStudio软件。数据然后进入管道,包括一些公开可用的商业软件,如CLC基因组工作台和数据库。我们使用数据库来过滤变体,和其他一些工具,包括电动汽车、HGMB ExAC, 1000基因组。

我们已经建立了自己的本地数据库在意大利人口变异的研究发现。大多数公开可用的数据库是基于北美或盎格鲁-撒克逊的基因型。我们的数据库地址有效意大利多态分布的变化,这是重要的生物信息学分析。

变异分析了生物信息学工具预测功能的影响,如排序从宽容宽容(筛选)和多态性表现型(PolyPhen)氨基酸替换,NNSplice和替代剪切位点预测(ASSP) RNA剪接。在体外功能蛋白质和RNA水平的评价往往是需要验证在网上预测。尽管我们试图验证变异使用湿实验室技术,这并不总是可能的。经常没有特定基因的功能鉴定评估。

问:如何NGS-based电池板的输出和周转时间MiSeq系统相比,利用Sanger测序确定变异?

英国《金融时报》:门店优于Sanger测序的基因数量分析和报告的输出和分析的复杂性。在桑格时代,我们能够一次只有一个基因序列的特定序列部分和生产报告,特定的基因。周转时间很长,我们可以只有有限数量的基因序列。

与门店,这需要大约两天来分析一个主题样本为200个基因。如果我们使用桑格测序,它可能需要几个月来完成同样的分析。

“我们已经确定了小说的基因和表型迅速使用有针对性的测序过程与MiSeq系统”。

问:您发现使用这个过程什么基因?

英国《金融时报》:我们已经确定了新的基因和表型迅速MiSeq系统使用目标排序的过程。我们设计我们的电池板尽可能包容,这意味着他们甚至包括罕见基因导致特定表型的兴趣。有时我们遇到意想不到的结果,如发生突变的基因,通常是由于不同的表型变异是如何展示的示例。在这些情况下,我们发现了一个新的表型在已知基因。

在两种情况下,我们发现小说基因外显子组测序。他们的样本测试受试者有髓鞘障碍,负面的初始屏幕和面板测序。突变比较少见。我们完成这两个基因的研究和工作尚未出版。小说总是有趣的发现基因与表型相关。

我们也致力于两篇论文报告有趣的情况下,我们获得了许多突变的结果与我们的脑白质营养不良和周围神经病变面板。对于罕见疾病的学科,是非常令人沮丧的不知道疾病的原因。因此,增加我们的潜力分析率是非常重要的。

问:你的实验室认为从桑格过渡到门店?

英国《金融时报》:这是一个戏剧性的变化从桑格切换到门店。上天得更为复杂,并不是每个人都使用这种新技术在一个完全自治。相对较少的成员,我们的团队准备了Nextera快速捕捉库或分析结果,但许多创造了Nextera XT库和执行排序。它改变了我们实验室的文化,人们看这个系统的可能性。

接下来的步骤是什么在你的研究?

英国《金融时报》:我们想与医生合作,获得样本病人,家庭成员,以及其他的亲戚和创建一个数据库的结果。它会在我们的研究中产生了重要的影响。它将使我们能有一个详细的数据库正常和病理的变体在意大利人口,从而提高过滤测序项目的权力。这不是我们能做自己的东西,因为我们不直接处理病人。

我们加入了一个欧洲以外的项目称为外显子组。项目的范围是集成不同的研究方法(RNA序列/转录组、蛋白质组学和WGS)尚未解决的情况下,已经经历了外显子组测序。我们将扩大我们的测序研究单个细胞和执行功能分析。我们期待在NextSeq RNA-Seq表演®500系统。

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