映射神经多样性：小鼠原发性视觉皮层中神经元特征的分子分析

介绍

Michio Kaku，美国未来学家，物理学家和作者写道，“人类大脑有100亿神经元，每个神经元都连接到10,000名其他神经元。坐在你的肩膀上是已知宇宙中最复杂的物体。“他的话毫不夸张。事实上，迄今为止，科学家们甚至不能告诉我们，我们可能在相对简单的哺乳动物大脑中找到多少种不同类型的神经元，就像鼠标一样，更不用说一个人。

艾伦脑科学研究所(Allen Institute for Brain Science)是一家独立的非营利研究机构，致力于了解大脑的内部工作方式，该机构正试图改变这一现状。Bosiljka Tasic博士，艾伦研究所细胞类型项目的研究员，正在开发先进的分子分析方法，分析转录组和单个神经元的表观遗传景观，以确定小鼠视觉系统中的神经元身份。她在iccommunity上谈到了艾伦研究所的使命，以及利用Illumina测序系统进行单细胞测序是如何改变神经元分类工作的。

问:艾伦脑科学研究所的使命是什么?

为了逃避抓捕已经做Tasic (BT):艾伦研究所的使命是加快对人类脑部的作用方式的理解。为了对这种雄心勃勃的使命产生影响，我们正在研究如何在构成小鼠脑中的各种细胞内编码和处理信息。鼠标是最可达的哺乳动物模型系统，并且在哺乳动物之间保守了许多信息处理原则。该计划是通过研究鼠标视觉系统来定义基本信息处理框架，然后将其与灵长类动物和人类进行比较以了解独特的人类。

为实现这一目标，我们有一个来自标准学术实验室的组织结构和规模。我们汇集了许多具有不同专业知识的科学家，并以真正的多学科方式在重叠的团队中组织它们。我们还向社区的百科全书资源提供这些研究的主要数据。我们的最新资源之一侧重于主要鼠标视觉皮质（称为V1或VISP）中的细胞类型，包括构成该脑区域的个体神经元的基因表达数据，生理学和形态。

问:V1由哪些类型的细胞组成?

英国电信(BT):V1是大脑皮层中处理视觉信息的主要区域。我们对这个皮层区域内细胞多样性的程度了解有限。我们知道主要的类型:兴奋性和抑制性神经元，以及非神经元细胞，以及这些主要类别中的一些进一步细分。虽然许多人已经对皮层进行了研究，但在单细胞水平上对细胞多样性和不同类型信息的相关性的全面描述并不存在。大多数研究通常基于几个参数，而不是高度多维的数据集。例如，如果你用三个基因对细胞进行分类，你可能会得到一张图片。然而，如果你观察所有的基因，你可能会得到一个非常不同的观点。

“我们可以使用单细胞mRNA测序检测每种细胞数千个基因，并为每个细胞进行高度多维数据集。”

问:为什么单细胞转录组测序是这些研究的有价值的工具?

英国电信(BT):单细胞转录组测序有利有几个原因。它是一种基因组技术，这意味着您分析到细胞中表达的所有基因的最佳近似。它为您提供了基于许多基因的细胞分集。我们可以使用单细胞mRNA测序检测每种细胞数千个基因，并为每个细胞获得高度多维数据集。在此之前，人们最多将基于几种基因表征细胞。如果你碰巧看着关键基因，那可能就足够了。但是，我们不知道重要的基因是什么。

问:你用单细胞mRNA-Seq发现了V1神经元细胞的什么?

英国电信(BT):我们不知道当我们开始单细胞mRNA-Seq研究时我们会看到什么。我们从V1转基因小鼠中收集了近1700个细胞，这些细胞通过了我们的质量控制标准，具有良好的测序信息。我们能够在V1皮质区定义49种类型，其中42种是神经元类型，7种是非神经元类型。¹在42种神经元类型中，我们发现大约一半是胃肠杆菌的神经元，而另一半是谷氨酰胺能神经元。

这种细胞分类分析的优点在于它是无偏的。当我们对这个单细胞数据集进行聚类和分解成组时，我们看不到V1中的细胞来自哪里(哪个细胞层和哪个转基因细胞系)。我们采用了两种并行的聚类方法，然后进行了第三种验证层分析，以确定在给定我们发现的基因表达特征的情况下，我们能如何有力地将每个单个细胞划分为一种类型。基于已知或新的标记基因，我们将兴奋性、抑制性或非神经元身份类型指定为事后型。

问:你发现了一些你称之为“模糊”的集群。这意味着什么，意味着什么?

英国电信(BT):当与我们的生物信息学家的工作，我希望能够检查我们为我们的细胞类型中获得的基因表达签名，然后问他们如何匹配这些类型的任何的每一个细胞。这考试，它采用了重复机器学习的方法，发现有时某些细胞会分成一个簇，有时甚至到另一个。yobet亚洲我们称这些“中间”的细胞，他们为我们提供了一个观点，你通常不会在研究论文看。这些都是有暧昧身份的细胞，它们是某些细胞类型中更为普遍。一些簇通过许多中间细胞“连接”。其它簇占据在该多维基因表达空间中的单数的位置和没有这些和其它集群之间的任何中间的细胞。

这些数据表明，并不是所有的细胞类型都有严格的离散身份。有些细胞类型可能无法清晰地分离，实际上可能是表型连续体的一部分。这对神经科学来说并不是一个陌生的概念，我们知道神经元会随着活动或经历而改变，并在动物的一生中拥有调整其行为所需的可塑性。

“通过NGS，我们确定了许多新的，以前未被发现的标记，其表达我们随后用替代方法确认。”

问：你以前用过什么技术来分析转录数？

英国电信(BT):我们与下一代测序（NGS）平行进行QRT-PCR。但是，QRT-PCR的问题是您并不总是知道您想要查看哪些基因。任何非基因组方法的问题是您可以花费大量的时间选择基因，并且仍然没有得到正确的答案。如果您没有将基因选择基于先前的基因组知识，则您的选择将被偏见，并且不会提供完整的转录组景观的良好代表性。

mRNA-Seq提供全基因组的基因表达谱，使我们能够特别选择最能说明转录组结构中分裂的基因。其中一些基因是已知的，但我们现在使用的许多基因是我们在用NGS识别它们之前不知道的单个神经元类型的最佳标记。相反，我们使用了文献中存在的基因，但许多基因没有被测试或检测到，因为每种方法都有自己的敏感性问题。通过NGS，我们发现了许多以前未发现的新标记，随后我们用其他方法证实了它们的表达。

问:你是如何进行细胞隔离的?

英国电信(BT):细胞分离是一个重大障碍。由于成体神经系统组织不易游离成悬浮物，因此很难分离成体活神经元。细胞高度相互关联，在细胞分离过程中，轴突和树突被撕裂，许多细胞无法存活。此外，为了访问一些罕见的细胞类型，我们需要分析许多细胞。因此，我们决定使用转基因Cre系作为细胞源，其中特定的细胞组用荧光蛋白标记。优化了成人脑细胞悬液的制备工艺，建立了荧光激活细胞分选(FACS)单细胞分离方法。所有这些都使我们能够分离那些罕见的群体，因为我们可以更频繁地取样罕见的细胞类型，而不是以一种公正的方式。因此，我们的细胞取样不是公正的，但我们有意地从可能标记罕见细胞类型的转基因株系中选择和分离细胞。我们使用这种方法获得了非常可靠的单细胞隔离。

英国电信(BT):通过使用MISEQ系统相对浅的测序，我们在实验室进行了图书馆验证测序。然后我们将更深入的库测序外包给具有Hiseq系统的几个本地核心实验室。

“拥有MISEQ系统内部的内部使我们能够迅速发展和改变我们的方法，并确认我们在我们将它们发送到核心实验室之前，我们在Hiseq系统上更深入排序之前有了一个好的图书馆。”

问：你为什么选择miseq系统？

英国电信(BT):我们需要一个快速营业额的系统，特别是在我们开发流程的时候进行图书馆验证。拥有MISEQ系统的内部，使我们能够迅速发展和更改我们的方法，并确认我们在向HISEQ系统发送到核心实验室之前，我们在核心实验室送到了核心实验室之前。这对我们来说是一个很好的组合。

问：您使用的是什么样的图书馆预备套件？

英国电信(BT):我们测试了几种方法，并选择了Clontech的智慧，因为它可以可靠地放大来自单个细胞的样品。对于我们的V1学习，我们使用了更智能的版本1.智能SEQ 4现已上市，我们正在使用它进行我们的新研究。对于从更智能获得的CDNA的库准备，我们使用了Nextera XT库预备套件。它允许我们使用少量CDNA用于NGS图书馆准备和旁路超声处理。

“在我们进行单细胞转录组分析之前，我们没有一种方法来获取异质组织并以一种公正的方式定义其中的分子类型。”

问：测序运行的参数是什么？

英国电信(BT):我们最初在排序深度上落后，因为我们不知道需要什么深度来获得用于区分新细胞类型的良好分辨率。我们将早期单细胞样本的cDNA测序到大约20-30万令吉，有时甚至更高。然后我们执行了读取的分支和聚类在Silico.并且决定，对于大多数细胞，每种细胞获得5-10百万总读数就足够了。

如果想要区分神经元和非神经元以及兴奋性和抑制性细胞，这种深度是不必要的。对于这些研究，可以使用更低的深度——每个细胞10万次或更少就足够了。然而，如果我们想要区分相关的神经元亚型，根据我们能够获得的细胞数量，我们肯定需要更深入的测序。

问：揭开了单细胞排序的信息，其他方法没有让您看到？

英国电信(BT):单细胞测序只在皮层细胞类型的分类做出了贡献，而不是。直到我们有单细胞转录组分析中，我们没有在一个公正的方式采取异质组织和定义分子类型中的一条出路。单细胞转录组让你组织分解成类型，而要先问“什么基因，我需要使用？”相反，我们可以看看所有的基因。

在单细胞测序之前，我们也不知道什么将构成不同细胞类型的合理综合指数。我们在谈论数千种类型吗？数量级是多少？我们的研究表明我们正在谈论50种不同的V1细胞类型，其中一些可能是模糊的。我不能要求我们的工作真正全面 - 可能有稀有的细胞类型我们没有识别。因此，最终可能会在这个大脑区域内有数十个。

最后，单细胞排序允许我们定义特定细胞类型特定的标记。对构建可以访问这些特定类型的工具具有巨大的含义。现在我们有一个食谱;例如：基因A加基因B将使我们特异性进入细胞类型Z.在我们只是猜测之前。这些新工具将使我们能够定义不同小区类型的功能，并调查它们在神经电路内的工作方式。

“比较来自不同皮层区域的单细胞mRNA-Seq数据将使我们能够提出与细胞类型的保存和独特性有关的新问题。”

问：你的研究中接下来是什么？

英国电信(BT):我们的研究是在某种程度上是试点研究。它表明我们可以在明确定义的解剖区域中用成人皮质细胞进行单细胞mRNA-SEQ。我们现在想配置其他明确的区域，尤其是其他皮质区域。从不同皮质区域的单细胞mRNA-SEQ数据比较，使我们能够提出与细胞类型的保护和唯一性有关的新问题。

我们有一些与外部学术实验室的合作，正在采用我们喜欢在他们最喜欢的大脑区域中分类细胞的方法。使用这种技术，我们可以分解大脑的任何区域，这可能来自v1具有巨大不同的功能角色。通过构建特定的遗传工具，我们可以询问某些细胞类型在我们对学习的具体行为中的某些细胞类型的功能是什么。这是非常令人兴奋。

MiSeq系统,www.169o.com/systems/miseq.html.

Hiseq系统，www.169o.com/systems/hiseq_2500_1500.html.

Nextera XT DNA文库准备试剂盒，www.169o.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html

参考

1。

Tasic B，Menon V，Nguyen TN，等。单细胞转录组学揭示的成年小鼠皮层细胞分类。Nat Neurosci.。2016;19(2): 335 - 346。

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