单细胞分析是发育生物学发展的见解

介绍

科尔杰尔博士是大礼帽的主要开发人员¹,袖扣²,单片眼镜³和其他生物信息学工具,进入了常用计算生物学家之一。他开始在生物信息学研究生马里兰大学,在那里获得了计算机科学博士学位。他原本没有计划从事生物学,但引起了他的兴趣同事使用Solexa测序和刚刚开始看到下一代测序(上天)数据。映射的问题短读回基因组,他意识到,一个高通量计算的问题。在John Rinn博士后的实验室在哈佛大学干细胞与再生生物学部门,他开创了使用单细胞转录组测序分析细胞分化的方法。

现在在美国华盛顿大学基因组科学杰尔博士使用Illumina公司门店数据专门为单细胞转录组分析和软件实验。他的实验室专注于单细胞基因组学技术。他的目标是确定发展是基因组中编码的程序如何通过识别基因回路将细胞从一种类型转换为另一个。识别这些电路是理解人类健康和疾病的关键。

为此,杰尔博士依靠NextSeq 550年,6000年NovaSeq,和一个跨学科的团队的科学家。“大多数人在实验室是跨学科的,”他说,“与计算机科学家进入钳工,或血液学家和肿瘤学家学习计算技术。”yobet亚洲

最近,杰尔博士和我们分享他的观点对理解细胞谱系的重要性,他的实验室的经验与RNA单细胞测序(scRNA-Seq),和他的应用程序组合索引,没有孤立的单个细胞基因组的分析。他还谈到了他的信念的力量协作和指导他如何调查哲学。

科尔杰尔博士系的助理教授是华盛顿大学基因组科学。

问:你如何方法研究开发?

科尔杰尔(CT):我们想知道基因电路的架构使用从一种类型转换为另一种细胞。,特别是发生在发展,但它也发生在疾病。我们感兴趣的项目开发以及它的基因组中编码。这是一个非常大的问题,而不是所有的混凝土。太大了,甚至很多实验室一起工作来回答。

我实验室的策略对回答这个问题取得进展,学习项目的发展是如何编码的DNA,是建立技术和软件,并把它们在世界各地的许多其他科学家的手中。yobet亚洲

我们围绕单细胞基因组学开发先进技术。可能是实验,就像一个新试验或一个新的协议,或者计算,像一个算法提取的新见解的实验我们已经做的。然后我们写一篇论文展示技术,对一个应用程序,该应用程序没有技术进步是很难做到的。我们投入25%的努力与人合作发展相关的问题或疾病,并与他们一起工作,我们的技术应用于他们的生物学问题。

问:所有你开发的软件是开源的。为什么?

CT:人们很乐意工作的一个软件来解决一个科学问题,因为它很有趣。如果你试图收费软件工具,是科学家,然后别人就会免费做。我想帮助别人。即使充电名义费用将大大降低用户基数的大小。大礼帽成为广泛使用的原因是它是解决这个问题的第一件事映射猎枪cDNA序列读取的基因组。花了很长时间更好的东西来。

问:什么是理解细胞谱系的重要性吗?

CT:理解发展是一项基本的生物学和目标的一部分价值在于满足我们的好奇心。我发现的一个例子是迷人的秀丽隐杆线虫。每个成人虫都有相同数量的细胞相同的细胞类型。这是一个程序,顺利地运行。所有的动物都是一样的。我们不这样的。我有一个不同的细胞的数量比你在我的身体,和它们是不同的类型,但你可能和l看起来差不多。了解发展的程序是可再生的,即使面对哺乳动物数量变化所产生的细胞从根本上是有趣的。

在实际应用方面,许多儿科疾病,例如,有一个发展组件。特别是对罕见的遗传性疾病,有我们能做的不多。然而,我们开始看到成功的地区有一个遗传因素或司机突变导致的疾病。如果你知道如何控制组织的基因电路开发工作在健康的人,你可以做一个预测是如何打破人的疾病和干预。

另一个应用程序在器官移植。有很多疾病可以治愈无限供应的移植器官。如果我们想让器官,我们需要了解他们得到了发展,因为我们想要让他们一致,重复性良好,强劲。

“单细胞RNA序列允许您使用DNA测序器作为显微镜来确定哪些基因在单个细胞活跃转录。”

问:scRNA-Seq的独特价值是什么?

CT:单细胞RNA序列允许您使用DNA测序器作为显微镜来确定哪些基因在单个细胞活跃转录。这是一种分析单个细胞的分子内容,在实践中,人们感兴趣在一个实验中,对许多细胞。

最基本的用途scRNA-Seq找出什么类型的细胞你看和你有多少细胞。你也可以发现新的细胞类型,如果你有一些不符合预期的分类。另一个应用程序是看到细胞如何应对一个扰动,如药物暴露环境刺激,引入疾病,或基因编辑。通常情况是,一些基因改变的反应。测量哪些基因改变可以帮助你找出扰动是如何工作的机械化,所以你可以做一些猜测细胞的分子机制。例如,如果你想了解化合物是如何工作的,杀死癌细胞,观察基因表达可以是非常有益的。

问:什么是scRNA-Seq的作用研究的发展?

CT:基因组已经解决的问题是,给定一个细胞,它需要程序的时间整个动物细胞分裂。细胞增殖在正确的时间和地点发展成肢体,大脑,心脏,肝脏,等等。他们都使用不同的基因。他们都做出不同的蛋白质。他们都执行不同的任务。他们都共同生活的功能。当一个细胞分裂成两个细胞,这些细胞的一个或两个将改变它做什么,成为一种新型的细胞。这些命运决定的时机是基因组中编码。如果你做一个scRNA-Seq实验发展的动物,你会捕捉单个细胞的不同命运决策的过程。

“拟时间”是我们使用的概念来组织数据到一个图片表示的顺序由命运决定在发展。有足够的时间点,你可以组装一个全面的发展计划正在从一个细胞到成人。由于scRNA-Seq,测量每一个基因的转录。你可以做一些推断基因活跃点发展,类型的细胞,猜猜哪个基因是参与决策过程的不同阶段。您可以识别的基因导致胰腺细胞发展成为一个分泌细胞而不是glucagon-secreting细胞。这是一个治疗关键理解命运决定。

问:参与scRNA-Seq的一些挑战是什么?

CT:单细胞的数据集是巨大的。你有成千上万的细胞。我的实验室刚刚发表了一篇论文,我们研究了超过一百万细胞的化学生物学扰动实验。你可能会耗尽内存做分析。可以解决一些软件,但是这意味着生物信息学人重写所有的代码来处理大型数据集。

另一个挑战是我们所说的稀疏。在这种背景下,它意味着你有一个单一基因的细胞表达5份,你想检测。你想知道有5份,但scRNA-Seq协议不捕捉每一个信使rna在细胞中。他们获取一小部分,你希望你捕获一个足够大的一部分,你可以告诉你的基因比较与其他基因表达。如果你不捕获一个足够大的分数,还有五册,你可能碰巧赶上没有基因在细胞的副本。这意味着你认为基因是关闭时,它不是真的,只是你没有发现它。缺乏证据的证据并不是缺乏。有很多的讨论和大量的工作是最好的战略来应对稀疏。

第三个挑战是分类。它有一个生物学组件和一个生物信息学组件。通常情况下,你想要做的第一件事是找出什么类型的细胞和你们的有多少人在你的数据集。通过观察可以看出,不管你的实验工作。当你准备组织的生物学组件。你必须创建一个悬浮的细胞。有很多不同的方式。他们中的一些人可能会咀嚼特定的细胞类型,离开别人完好无损,离开别人没有完全分离。然后你测序实验,你会发现你失去了你最喜欢的神经元或者你失踪的成纤维细胞。这是糟糕的如果你研究纤维化。

我们解决生物信息学与加内特组件⁴软件。在成纤维细胞的例子中,没有一个完美的基因表达的所有类型的成纤维细胞,其他什么地方也没去。有一个灰色地带。你发现细胞表达四个,五个你希望看到在成纤维细胞的基因,所以它们可能是成纤维细胞,但它们可能是别的东西。人们会使图细胞集群,每个集群是一种细胞类型。这是有问题的原因有三。第一,它非常的费时费力。两个,因为它不是系统的,如果你改变聚类标准,你必须回去重做。3、如果集群数据集,然后将聚类算法应用于一个集群,一个集群将分成三个或四个或五个集群。你有一个细胞类型或五细胞类型? The assumption you’re making about how cell type is defined by the transcriptome and clustering is not really correct.

我们想让一个与系统的深入了解细胞生物学家,写下他们希望表达的基因在每个细胞类型提前和应用系统的数据集,然后分数根据这些期望每一个细胞。有很多额外的机器学习,让它工作得很好,但结果是加内特。yobet亚洲加内特是一个分类器,我们希望将根据类型自动计数细胞的过程。

“我们希望允许细胞生物学家与深的知识系统写下他们希望表达的基因,每一个细胞类型提前和应用系统的数据集……结果是加内特。”

问:什么是轨迹分析?

CT:当细胞从一种类型转换到另一个地方,有一个连续体的基因表达。细胞不会分裂成两个离散群体。有些基因打开或关闭之前。轨迹分析试图组织细胞在多大程度上他们是通过过渡的过程。知道是很重要的,因为早期基因打开一开始是重要的决策过程和随后的基因来决定可能不是那么重要。在心肌细胞的情况下,这可能是重要的对于心肌细胞做的做事情,像跳动,但也许他们不是重要的决定成为一个心肌细胞。

问:什么是单片眼镜吗?

CT:单片眼镜是一种软件工具,也是一个活跃的研究项目。它与scRNA-Seq介绍了轨迹分析的概念。主要有三个版本的单片眼镜。早期的版本是能够处理简单的实验只有几百个细胞。在过去的五年里,我的实验室发布了与机器学习更好的版本的单片眼镜,组织细胞根据其基因。yobet亚洲它是一个开源的程序写在R和任何人都可以免费下载。

第二个版本专注于更大的数据集,并试图确定的命运轨迹决策点,一些细胞的一种方法,去另一个地方。第三版做同样的事情,但是在规模和复杂性我们需要做老鼠胚胎的实验。在这个研究中,有成百上千的细胞类型区分,还有一些特殊的问题需要解决。

问:为什么SCI-Seq视为突破?

CT:单细胞组合索引和排序⁵或SCI-Seq做单细胞基因组学是一个方案。你可以测量RNA-Seq ATAC-Seq⁴,这是一个表观遗传分析,措施染色体DNA的DNA结合能力,和其他东西。达伦Cusanovich Risa Daza,博士后和员工科学家Jay Shendure的实验室,分别是第一个人想出一个组合indexing-based单细胞协议。他们发现你可以做单细胞基因组学实际上没有物理隔离的单个细胞。

传统,人做的事情是把一个细胞从一个悬架成一个96孔板的,在未来,把另一个细胞,然后在每个库。这很好,但很费力,没有很好地伸缩。

组合索引是非常不同的。你填充每个细胞,戳洞,做细胞内的图书馆建设的第一步。在RNA-Seq,第一步是逆转录。然后你标签的产品序列对应于执行的良好反应。细胞仍然完好无损,池在一起,并将它们添加到一个新的96孔板。SCI-Seq而言,你标签他们再次在PCR阶段。这意味着每个RNA-Seq片段,你穿上音序器现在标记两次,一次从第一,一次从第二好,所以你有96乘以96可能对。如果你只把1000个细胞通过工作流,当你看到两个读同一双识别条形码,可以推断出他们来自相同的细胞。你可以做额外的索引。做两个标签板块,而是你做三,与成千上万的细胞进行实验。

有许多不同的方法可以部署这个概念和测量的对象不同。你可以测量超过一个位于相同的单元中。Jay Shendure我有一篇论文,我们在做ATAC-Seq和RNA-Seq相同的细胞。所有这些SCI-Seq工作已经与Illumina公司合作。

问:你有什么建议让人们第一次进入单细胞基因组学吗?

CT:我一直印象深刻,当我已经在访问速度的新技术已经掌握,特别是由研究生和博士后。有一个真正的野心采用它。实验室正考虑做他们的第一个实验中,我想说的是准备的现实生成数据需要几个星期和几个月来分析它。数据集是非常复杂的。生物学总是复杂。特别是RNA-Seq,推断出一些信号通路的动力学基于转录可以非常具有挑战性的。

材料是昂贵的。很有可能,如果你不设置实验在正确的方式,那么你可能无法得出结论,你已经花了不少钱。的诱惑会先做一个小实验,但你可能要考虑一个更大的实验更多的控制和更好的设计。它从长远来看可能会比较便宜。

关于生物信息学,我肯定会带着一个非常清楚的基因,你希望表达具体的每一个细胞。你需要将细胞在此基础上,系统的专家。更广泛的细胞生物学的知识社区并没有被抓获,程序可以从转录数据标签细胞类型。

准备好做一些编程。舒适与R或Python,至少在一个基本水平。你会写一些代码。使用论坛。有论坛的主要工具和软件开发人员不能跟上所有的邮件。

“我想看到所有的事情我们可以想象测量单个细胞民主化和部署在生物学和医学的世界。我认为你可以提取的见解,与其他技术真的很困难。"

问:单细胞基因组学的下一步计划是什么?

CT:一篇论文就出来一个扩展SCI-Seq称为sci-Plex。这是一种从许多不同的条件,看数以百万计的细胞,它允许我们做药物筛选。而不是构建地图册中所有细胞类型的有机体,我们正在试图做的大扰动实验和构建基因调控的定量模型,揭示机械化的扰动是如何工作的。你可以想象用理解的作用机制复合,你知道是一个打击,但你不知道它是如何工作的。

问:什么是你的长期愿景单细胞基因组学?

CT:我希望看到所有的事情我们可以想象测量单个细胞民主化和部署在生物学和医学的世界。我认为你可以提取的见解,与其他技术真的很困难。我很困惑,我们的DNA编码基本上是最复杂和美丽的程序,我们曾经遇到作为一个物种,我想知道它如何产生很多不同的细胞类型,做很多不同的事情从一个单一的、静态的程序。即使我们可以理解它一小块,像基因组编码的精确模式空间组织的细胞器官,这是一个胜利。

yobet亚洲亚博官网人口了解更多关于本文中提到的产品和系统:

NovaSeq 6000系统,www.169o.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html

NextSeq 500系统,www.169o.com/systems/sequencing-platforms/nextseq.html

yobet亚洲亚博官网人口了解更多关于单细胞测序:

Illumina公司单细胞测序和分析工作流,//www.169o.com/company/video-hub/CVaSHbQg-P8.html

注意事项、趋势和未来的单细胞测序,//www.169o.com/company/video-hub/oUFFGVzIgEw.html

引用

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3. 杰尔C, Cacciarelli D,格里姆斯比J et al。细胞命运决定的动力学和监管机构透露pseudotemporal订购的单个细胞。生物科技Nat》。2014年,32 (4):381 - 386。
4. 多段线H, Shendure J,杰尔C。监督分类使细胞地图册的快速注释。Nat方法。2019;16 (10):983 - 986。
5. 曹J、封隔器JS Ramani V et al。全面的多细胞生物的单细胞转录剖析。科学。2017;357 (6352):661 - 667

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