解读长链非编码RNA在癌症中的作用

简介

Jo Vandesompele教授博士对RNA有特殊的亲和力。这始于他的博士论文研究，他使用逆转录酶定量PCR (RT-qPCR)来研究RNA在成神经细胞瘤中的作用。从那以后他就迷上了RNA。这是他在根特大学(Ghent University)的功能癌症基因组学小组和他在2007年创立的Biogazelle公司的重点，Biogazelle公司提供RNA分析和实验设计服务。

“我认为RNA是一种迷人的分子，”凡德桑贝利教授说。他在一次会议上听了一个关于长链非编码RNA (lncRNA)的报告后，就开始专注于一种特定类型的RNA。lncrna被认为是人类体内大量特化细胞的来源，并调控细胞在转录上的组织。某些癌细胞似乎对某些lncrna的存在上瘾，当转录被沉默时，它们就会死亡。Vandesompele教授补充说:“我们立即意识到lncrna的力量，并开始使用不同的文库准备方法进行研究，研究这些转录本及其在各种癌症中的作用。”“我们在根特大学和Biogazelle的团队被公认为lncrna的世界专家。”

iccommunity与Vandesompele教授讨论了lncrna在理解癌症方面的价值，而不是只关注DNA标记，以及如何将它们用作开发新的癌症诊断和治疗方法的靶点。亚博下载app我们还讨论了他们如何使用NextSeq™500系统和TruSeq™RNA外显子组来识别高度碎片化样本中的RNA标记，如福尔马林固定、石蜡包覆(FFPE)组织样本和液体活检。

Jo Vandesompele博士，根特大学教授，Biogazelle联合创始人兼首席科学官。

问:是什么激发了你对RNA，特别是lncRNA的兴趣?

乔Vandesompele(企业):当我在研究生院进行成神经细胞瘤的研究时，我开始对RNA感兴趣。我想要找到起源细胞，它们是稀有细胞。Northern blot和微阵列需要太多的RNA，所以我使用RT-qPCR，这在当时是一种新方法。

2009年，我参加了一个Keystone会议，第一次了解到lncrna。yobet亚洲当时，只有大约1700个lncRNA序列被识别出来。我们认识到lncrna作为生物标志物的力量，并设计了qPCR方法来量化它们。通过我们和世界各地研究人员的努力，lncRNA数据库的序列增加到4000个，后来增加到18000个。

问:您用什么技术来研究lncrna ?

珍:随着lncRNA数据库的增长，很明显qPCR不再是一种有效的检测方法。我们设计了一个微阵列，然后使用不同的文库准备方法过渡到全RNA-Seq。当时进行全rna测序的研究人员并不多，今天仍然如此。大多数研究人员依赖于polyA RNA- seq，即使它只捕获有polyA尾巴的RNA。我们估计有一半的lncrna没有这样的尾巴。

问:lncRNA在人体内的作用是什么?

珍:我们对lncRNA在人体中的作用的了解还只是冰山一角。当我们进行实验时，出现的主题之一是lncRNA的极端组织和细胞类型特异性。lncrna似乎可以解释人类生活的复杂性。虽然苍蝇、西红柿和人类有很大的不同，但它们的蛋白质编码基因数量几乎相同。然而，人类要复杂得多，全身有许多专门的细胞类型。研究人员曾认为这是由于选择性剪接或翻译后蛋白修饰。这在某种程度上可能是对的。然而，从转录调控的角度来看，lncrna在组织细胞的过程中起着重要的作用，这一点已经很清楚了。我们认为lncrna就像胶水一样，要么把蛋白质带到DNA上，要么把蛋白质附着到RNA上，要么把不同的RNA分子粘合在一起形成支架。另一种可能性是，它们将重要分子从它们不应该在的地方滴定出去，或将它们带到它们需要在的地方。

“lncrna的表达特异性可以用来揭示细胞的状态。”

问:lncrna能告诉我们关于细胞状态的什么信息?

珍:lncrna的表达特异性可以用来揭示细胞的状态。迄今为止，大约有5万个lncrna被鉴定出来，而且这个数字还在增长。lncrna在表达的时间和位置上非常特定，在任何特定的细胞类型中只有一小部分表达。一旦我们弄清楚一种特定lncRNA在何时何地表达的编码，我们就可以识别细胞类型和细胞状态，比如它是健康的还是患病的。通过研究这些细yobet亚洲胞类型的特异性，我们可以学到很多东西。

问:如何将lncrna用作诊断和治疗开发的生物标志物?

珍:如果一种lncRNA在特定的细胞或组织中特异性表达，那么它一定在该细胞中具有重要功能是合乎逻辑的。事实证明，一些细胞，特别是某些癌细胞，对存在的lncrna上瘾。我们发现的第一批lncrna之一是SAMMSON，它只在皮肤黑色素瘤中表达。与合作者一起，我们发现沉默SAMMSON会破坏某些线粒体功能并杀死癌细胞。¹

SAMMSON是数百种癌细胞类型特异性lncrna中的一种，如果我们移除它，癌细胞就会不高兴，要么不再增殖，要么死亡。我们可以对lncrna进行合理的药物设计，以开发治疗方法，同时也有相应的诊断。如果我们知道lncRNA的序列，并可以设计测定方法来测量它，我们就可以识别对这些lncRNA上瘾的疾病或癌细胞，并使用沉默技术关闭它们。基于CRISPR和sirna的方法正在开发中。反义核苷酸是最先进的，为开发lncrna靶向治疗提供了一种有前途的方法。

lncrna在肿瘤学、神经学和其他疾病类型的领域提供了希望。市场上有少量反义药物，如inotersen、nusinersen、eteplirsen和mipomersen，还有100多个临床试验评估反义寡核苷酸。这类药物易于管理，并通过减少RNA或修改剪接作用。²我们正处于一种全新的药物的开端。

问:您在根特大学进行哪种类型的lncRNA研究?

珍:虽然我们最初专注于儿童癌症，但我们意识到我们的技术可以应用于所有类型的癌症。我们现在专注于十几种癌症，包括前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、食道癌、肺癌和成神经细胞瘤。我们正试图尽可能广泛地开展研究，并与专家合作者和关键意见领袖合作，以推进这些研究。

“大多数研究人员依赖polyA RNA- seq，即使它只捕获有polyA尾巴的RNA。我们估计有一半的lncrna没有这样的尾巴。”

问:Biogazelle的客户构成是什么?你们提供什么服务?

珍:我们主要与制药、生物技术和临床研究人员合作。我们提供从A到Z的服务，从RNA生物标志物发现到定制RNA量化研究，到执行高通量反义寡核苷酸筛选，识别、测量和沉默lncRNA靶点，并协助客户进行先导药物发现和临床前研究。

我们不仅仅是向客户提供数据。我们帮助他们对项目进行思考，提供可操作的见解和结果，以便他们能够继续进行。我们拥有博士级别的项目经理，他们参与所有的项目讨论并协助实验设计。我们在质量控制的环境中应用我们的方法，通过ISO 17025认证，并能在良好临床实验室规范(GCLP)标准下工作，这对我们的制药客户非常重要。

我们还有一个研究部门，与Illumina有很多合作。该团队专注于开发新的RNA量化方法，使我们的客户能够做以前不可能做的事情，特别是在液体活检领域。

问:您是什么时候开始使用Illumina NGS系统的?

珍:我们在根特大学的第一个NGS系统是Roche 454系统。我们只用它来做DNA分析。人们抱怨它使用起来既困难又昂贵。大约在同一时间，我们购买了一个基因组分析仪™₂系统。2014年，我中心诊断实验室获得了MiSeq™系统。他们对它非常满意，认为它使用方便，价格实惠。大约在同一时间，Biogazelle团队购买了NextSeq 500系统来执行RNA-Seq。从那时起，我们又获得了第二台NextSeq 500系统。

问:你在分析什么类型的样品?

珍:我们分析的大部分样本都是高度碎片化的癌症样本，如FFPE组织样本和液体活检。^3.TruSeq RNA外显子组是解决FFPE和液体活检样本的一个很好的解决方案，结合了超低输入和高片段RNA的挑战。它将总RNA转化为已知链源的模板分子，然后对编码RNA进行序列捕获。其他的全RNA准备方法需要对内含子进行大量的读取，这些读取并不总是有意义的，生成的数据质量也较低。

问:样品处理后，你们如何判断是否有足够的数据?

珍:每一步，我们都进行质量控制。在样品接收时，我们检查体积，以确保它是客户在标签上声明的。对于FFPE样品，我们在纯度和完整性方面进行量化。不幸的是，对于液体活检来说，我们一开始无法获得完整性或纯度，因为浓度太低了。当我们有预捕获的cDNA来查看片段分析仪上的预纯化文库时，我们第一次可以在液体活检中验证这些。这可以用任何微流体设备进行评估，并在90%以上的时间内工作。有时我们必须重复分析，所以我们要确保我们有足够的RNA。

在富集和文库纯化后，我们进行另一次浓度方面的QC，以确保我们有等摩尔池。通过这些QC步骤后，我们在NextSeq 500系统上执行RNA-Seq以获得高质量的数据。

生成高质量的数据非常重要。许多服务提供商没有意识到的是，批处理效应发生在测序过程中。为了避免它们，我们学会了打乱和随机抽样。yobet亚洲当客户给我们寄样品时，总是有一个特定的订单。因此，我们在样本接收、提取和库准备过程中对样本进行随机处理，以消除批处理效应。我们还确保我们有质量和批量控制的试剂，这样我们就不会引入批量效应。从测序的角度来看，我们试图扩大索引的数量，以获得尽可能多的样本。对于几乎所有的库，我们现在有多达96个索引，对于一些应用程序(如3'端测序)甚至更高。

“如果我们知道lncRNA序列，并可以设计测试方法来测量它，我们就可以识别对这些lncRNA上瘾的疾病或癌细胞，并使用沉默技术关闭它们。”

问:您是否使用RNA-Seq来识别样本中存在的突变?

珍:我们很愿意识别癌症标本中的突变，以及剪接变异和基因融合，但许多人都很保守，希望我们只进行基因水平的量化。

这有点不幸，因为他们没有利用丰富的RNA-Seq数据。例如，替换拼接很容易检测。此外，现在有一种新的剪接类型叫做环状RNA (circRNA)，它起源于反向剪接。最近的三篇论文记录了circRNA作为治疗靶点或新型生物标志物的潜力。^{4 - 6}CircRNA不能用经典的polyA测序来识别，因为它们没有polyA尾巴，这可能是人们没有注意到它们的原因。

我们正在推动这项技术，看看我们是否也能识别RNA-Seq数据中的其他突变。客户从DNA层面理解价值。在RNA水平上是另一回事。例如，RNA编辑是一种令人困惑但有趣的现象。我认为我们才刚刚开始了解RNA编辑在疾病生物学中的重要性。然而，RNA的动态范围是一个问题，因为覆盖率取决于每个基因的表达水平。如果我们想要以相当高的灵敏度检测低频突变，我们需要对低丰度rna进行30倍的覆盖。这就消耗掉了所有排在最前面的基因的测序读数。

问:RNA编辑有哪些可能的应用?

珍:RNA编辑可用于评估肿瘤突变负荷(TMB)。TMB测量癌细胞携带的所有突变，对于预测免疫肿瘤疗法的应答或无应答非常重要。

研究人员一直在DNA水平上研究TMB，可能是因为它太简单了。虽然这对RNA来说是一个挑战，但它是可行的和有价值的。TMB高的肿瘤细胞有更多的新抗原，可以被免疫系统识别，引发抗肿瘤反应。RNA- seq数据中表达的非同义突变可能产生新抗原，而RNA编辑则是新抗原的另一个来源。

我们有初步数据表明，我们所说的表达TMB (eTMB)和基于dna的TMB评分之间有很强的相关性。我们正在与合作伙伴进行临床数据的大规模研究，以表明如果我们结合RNA编辑产生的新抗原的表达变体，我们可能有一个更好的对检查点抑制剂反应的预测器。检测灵敏度将不那么重要，因为TMB评分是蛋白质编码基因的每个测序兆酶的非同义突变的数量。目前的TMB液体活检方法只观察了几百个基因。有了RNA-Seq，我们可以观察更多的基因，得到更丰富的数据。我们看到利用RNA进行这类分析的巨大潜力。

“RNA编辑在评估肿瘤突变负担(TMB)方面可能有价值。”

问:Biogazelle是否也协助公司进行临床前研究?

珍:当我们在发现项目中应用RNA测序时，我们转而使用qPCR来开发诊断分析方法，用于临床前研究，对受试者进行分类，并作为辅助分析。在其中一个开发阶段，我们使用了我们用于RNA-Seq发现研究的相同样本，以确保我们可以使用qPCR作为正交验证方法复制发现。我们的大多数客户和合作伙伴想要临床级的检测，通常qPCR就足够好了。这种情况在未来可能会改变，但目前还没有太多的RNA测序临床分析。使用qPCR，我们可以创建一个质量可控的临床级诊断试剂盒。

问:你做什么类型的数据分析?

珍:我们首先比较样本或样本组进行差异基因表达分析。然后，我们超越了这种经典的观察RNA的方式，使用两种先进的生物信息学方法来评估基因签名。首先是基因集富集分析，使用布罗德研究所的基因集富集分析算法。它可以根据折叠变化差异或P值对基因进行排序。它是一种识别微妙模式的稳健而灵敏的计算方法。它可以揭示基因集或通路级别的信息，使我们能够了解样本组中发生了什么。

第二种方法是反褶积分析，以估计RNA样本中存在的不同细胞或组织类型的贡献。肿瘤主要由癌细胞、基质细胞和免疫细胞组成。使用反褶积方法，我们可以知道肿瘤中的细胞类型和比例。我们也将这种方法应用到液体中，尽管成功与否取决于细胞和组织类型的基因特征的质量。然而，在流体中的反褶积的结果已经揭示。我们可以在血浆、尿液和脑脊液(CSF)中看到各种有意义的细胞类型特征，并显示随时间的变化。这些RNA信号可以用来证明癌症是否存在、是否复发或是否缓解。我希望利用这些先进的分析方法能有一些重要的发现。

问:你们向客户提供什么数据?

珍:我们提供给客户的数据取决于他们需要回答的问题。通常，他们需要基因级别的量化数据。然而，对剪接变异、突变分析、RNA编辑和环状RNA数据的需求正在增加。客户收到原始和处理过的数据，以及结果报告。

“在液体活检领域和肿瘤学领域之外，RNA分析有显著的增长机会。”

问:RNA-Seq与DNA测序数据在疾病评估中的价值是什么?

珍:我相信RNA-Seq数据提供了与DNA测序相同的信息，如果不是更多的话。除了基因表达分析，我们还可以确定拷贝数的变化^{7 8},突变⁷和RNA编辑，并进行t细胞受体分析⁹还有免疫细胞分析。¹⁰如果从蛋白质编码区域到lncRNA，生物标志物的潜力也明显更大，lncRNA中有5万个潜在基因，而蛋白质编码基因有2万个。最终，它的价值可能在于同时观察RNA和DNA的特征来评估癌症或疾病样本。

问:您认为液体活检检测在未来将如何发展?

珍:基于DNA分析的液体活检检测在肿瘤学应用中增长迅速。我刚刚在2019年精密液体活检大会上发表了讲话，希望我成功地传达了RNA分析在液体活检中的价值。DNA本身是不够动态的，反应也不够灵敏。充其量，ctDNA能透露一些关于癌细胞和突变的信息。它没有说明宿主是如何对肿瘤作出反应的，也没有说明免疫系统或基质细胞是如何与肿瘤相互作用的。我们可以通过RNA分析看到这些信号，包括囊泡和血小板的变化。有一个新的领域专注于肿瘤受教育的血小板，而且围绕使用纯化囊泡治疗各种类型的人类疾病，如癌症或心脏病，正在开发新的治疗方法。RNA分析在液体活检领域和肿瘤学领域之外有显著的增长机会。

问:Biogazelle的下一步发展计划是什么?

珍:我们希望扩大Biogazelle在欧洲以外的客户群，并继续提供独特的服务。我们不仅仅是一家RNA-Seq服务提供商。我们设计实验并进行广泛的生物信息分析，为客户提供对数据的洞察，并支持他们下一步开发有价值的诊断和治疗方法。亚博下载app我们只需要把消息传播出去。

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参考文献

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