DNA输入建议
该协议支持从高质量样本或FFPE组织中提取1- 50ng的人类gDNA (1ng相当于~300个基因组拷贝)。建议每池输入10ng高质量DNA。在开始实验前，量化并稀释输入DNA到所需浓度。
- 在这个范围内增加输入DNA的数量通常会导致更高的文库质量，特别是在DNA质量未知的情况下。
- 不要超过输入DNA的最大支持量。
- 只使用1 ng的gDNA与高质量的，充分量化的样品。
- 对于像FFPE DNA这样的降解库样品，库产率可以更低。抑制因子如高黑色素含量会降低目标扩增的效率。
输入DNA量化
使用基于荧光的定量方法定量起始DNA，如Qubit dsDNA HS Assay Kit或PicoGreen。不要使用基于紫外线光谱仪的方法。
- 基于荧光的方法使用一种针对双链DNA (dsDNA)的染料，并能准确准确地量化dsDNA，即使在许多常见污染物存在的情况下也是如此。
- 相比之下，基于260 OD读数的紫外光谱仪方法可能会高估DNA浓度。过高的估计是由于RNA和gDNA制备中常见的其他污染物的存在。
有限的样本
平均碎片尺寸小于amplicon尺寸的降解样品仍然可以产生用于Illumina综合面板v3库的amplicon。
RNA输入建议
AmpliSeq Comprehensive Panel v3 RNA协议将RNA反向转录为cDNA。每个逆转录反应需要2-100 ng经dnase处理的总RNA。建议每个池输入10 ng RNA。在开始实验前，量化并稀释输入RNA至所需浓度。
- 在这个范围内增加输入RNA的数量通常会产生更高质量的文库，特别是在RNA质量未知的情况下。
- 不要超过最大支持的RNA输入量。
- 只对高质量、充分量化的样本使用1克总RNA。
- 用标准核酸纯化试剂盒分离总RNA。
- 使用基于荧光的定量方法定量起始RNA，如Qubit RNA HS Assay Kit或quantibit RiboGreen RNA Assay Kit。不要使用基于紫外线光谱仪的方法。
- 对于像FFPE RNA这样的降解库样品，库产率可能更低。