DNA输入建议
该方案支持从高质量样本或FFPE组织中提取1 ~ 100 ng (1 ng相当于300个基因组拷贝)的人类gDNA。建议输入10ng高质量DNA。在开始试验前，定量并稀释输入的DNA至所需浓度。
- 在这个范围内增加输入DNA的数量通常会导致更高的文库质量，特别是当DNA质量未知时。
- 不要超过输入DNA的最大支持量。
- 仅使用1 NG GDNA，仅具有高质量，良好的样品。
- 对于降解的文库样本，如FFPE DNA，文库产率较低。黑色素含量高等抑制剂会降低目标扩增的效率。
输入DNA量化
使用基于荧光的定量方法，如Qubit dsDNA HS Assay Kit或PicoGreen，对起始DNA进行量化。不要使用基于UV光谱仪的方法。
- 基于荧光的方法采用了一种针对双链DNA (dsDNA)的染料，并能特异性和准确地量化dsDNA，即使存在许多常见的污染物。
- 相比之下，基于260 OD值读数的紫外分光计方法可能会高估DNA浓度。过高的估计是由于存在RNA和gDNA制备中常见的其他污染物。
有限的样本
具有比扩增子尺寸短的平均片段尺寸的降级样品仍然可以为Illumina对焦面板库产生扩增子。
RNA输入建议
扩增仪对焦面板RNA协议逆转录RNA进入cDNA。每个逆转录反应需要1-100ng的DNase处理的总RNA。推荐的输入为10 ng RNA。在开始方案之前，量化并稀释输入RNA至所需的浓度。
- 在这个范围内增加输入RNA的数量通常会产生更高质量的文库，特别是在RNA质量未知的情况下。
- 不要超过输入RNA的最大支持量。
- 仅使用高质量、精确定量的样本，每个池使用1ng总RNA。
- 使用标准核酸纯化试剂盒分离总RNA。
- 使用基于荧光的定量方法量化起始RNA，例如Qubit RNA HS测定试剂盒或定量RiboGreen RNA测定试剂盒。不要使用基于UV光谱仪的方法。
- 降解的文库样品如FFPE RNA，图书馆产率可能降低。