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上游和下游探头设计的长度可以在22 bp到30 bp之间变化，而不考虑放大器的大小。
目标区域覆盖率计算为所要求的目标区域中碱基与所设计的扩增子序列的比例。所设计的扩增子序列区域包括固定侧翼探针和中间探针。
是的。“避免snp”设计选项也避免了在可能的情况下从给定的变体数据库中使用索引(例如人类设计的dbSNP)。
对于具有已知indel的重要区域，Illumina建议使用网格中每个项目的链接UCSC轨道来检查探针。在某些情况下，探针重叠索引可能是提供该区域覆盖的最佳或唯一选择。
允许的最大行数为1000。每个项目可以提交多个文件。
如果上游或下游扩增子引物区域与输入基因组DNA的实际变体重叠，则相对于多路反应中的其他扩增子，检测的特异性和/或均匀性会降低。
目标区域之间需要一个等效于最大放大子尺寸的间隙;小于此间隙大小的区域被合并，以提高设计性能，并防止不利的探测对探测交互。下表显示了给定放大器尺寸设置的最大和最小放大器长度。
设置 |
最低 | 最大 | |
| 140 | 125 | 140 | |
| 175 | 125 | 175 | |
| 275 | 125 | 275 | |
| 375 | 125 | 375 |
对于给定的目标区域，可以输入24kb的连续序列限制，以避免淹没设计服务器内存资源。
当Avoid SNPs被打开时，DesignStudio会考虑多态的位置，并在可能的情况下避免它们。如果这是不可能的，它将把探针放置在不干扰其绑定的区域。
选择最佳探针的算法考虑了熔化温度(Tm)、GC %、长度、二级结构、基因组的唯一性和潜在SNPs的存在(基于dbSNP)。有关更多信息，请参阅DesignStudio的在线帮助。
变体调用只在位于上游和下游探针位置之间的扩增子区域执行。在FuPa步骤中，探针区被消化。
不。这是一个多重PCR不能区分顶部和底部链。
该试验每个引物库使用1 - 100ng DNA，大多数设计使用10ng每个引物库。
商业上可获得的或实验室验证的DNA提取方法通常可以得到与该检测兼容的DNA。DNA纯度A260/A280比值应在1.8-2.0之间。建议使用PicoGreen进行准确定量。
DesignStudio接受以下输入:
在文件上传部分提供了用于添加新目标区域的坐标和基因模板。有关更多信息，请参阅DesignStudio在线帮助。
当扩增子长度为140或175 bp时，只能使用ffpe衍生的DNA。当样本输入是ffpe衍生的DNA片段时，较短的扩增子比较长的扩增子提供更好的扩增效果。
每个水池有12- 6144对引物的限制。如果生成的目标区域大于5Mb，我们建议选择一个增强选项。
该分析总耗时少于8小时，动手时间为2-3小时。这些库可以立即与MiSeq、MinSeq和NextSeq系统兼容，而无需任何进一步的操作。
扩增子是由PCR等扩增事件产生的DNA片段。在DesignStudio中创建项目时，Amplicon大小由用户选择。
Amplicon尺寸可以是140,175,275或375 bp的长度。
是的。考虑到每个反应的扩增子数量和输入DNA(如FFPE)的类型和数量，PCR循环的数量已经针对不同的分析条件进行了优化。推荐的PCR周期数将确保足够的产量，避免过度扩增。
理想情况下，在两个单独的房间进行pcr前和pcr后程序。如果使用单独的设备(如:振动筛、热块、离心机)并保持严格的清洁时间表，则可以在同一房间内指定的、不相邻的区域进行分析。定期漂白在参考指南中有概述。此外，还建议使用过滤过的吸管头。
目前，该试剂盒支持在单个池中多达6144对引物。多重反应中扩增子的数量将根据定制的设计而不同，范围从12- 6144对引物(6-3072个扩增子)。如果需要更多的扩增子，两个反应可以用相同的基因组DNA样本输入。一个用户可以轻松地在一天内准备150,000个测序准备放大器(96个样本x 1,536个放大器)。
不。这些分析使用了不同的寡核苷酸。
每个扩增子设计一对引物。多重PCR反应扩增目标区域感兴趣。扩增子的消化和适配器的随后连接生成索引库。然后，将DNA模板进行PCR扩增，汇集到单个试管中，并在MiSeq、MiniSeq或NextSeq系统上进行测序。有关该试验的更多细节，请参阅试验参考指南。
至于DNA板，客户应购买:
对于RNA面板，客户还应该从LTN-T购买SuperScript VILO套件。
对于140-275 bp的放大子尺寸，MiSeq仪器推荐使用2×150 bp的对端读数。对于375 bp的放大子尺寸，推荐使用2×250 bp的配对末端运行。
该试剂盒集成了样品条形码，每次测序最多可收集96bsample。然而，每次测序可以汇集在一起的样本的实际数量取决于扩增子的数量和所需的测序覆盖深度。DesignStudio提供了一个在线计算器来帮助进行这些计算。
该工具包有以下软件工具:Illumina实验管理器，MiSeq Reporter，和Illumina Amplicon Viewer。
MiSeq Reporter是一个简单的，仪器上的软件，可以解复用索引/样本，执行读取对齐，并在每次测序运行完成后立即创建一个不同的报告。MiSeq Reporter还为每个扩增子创建一个组装(在每个样本的基础上)，每个SNP调用，并生成图形和报告，包括每个扩增子的测序覆盖率。
Illumina Amplicon Viewer可以通过多次运行和自定义报告生成来实现数据可视化。分析工作流程可用于检测生殖系和体细胞变异的测序样本。
有关实验数据的示例，请参见数据集BaseSpace可用。样本数据集来自于对ffpe衍生DNA进行MiSeq测序的TruSeq Amplicon Cancer Panel。
DesignStudio返回高自信的放大器设计，提供了前所未有的放大器多路复用性能。可预期特异性和均匀性>分别为70%/80%。在实践中，我们观察到数百种设计的特异性和统一性达90%。
不。HiSeq系统的文件目录结构与MiSeq Reporter软件不兼容。
然而，DNA Amplicon和RNA Amplicon应用程序在BaseSpace中可用，可以用来分析该试剂盒。