输入要求

输入要求

Nextera快速捕获富集文库制备采用了酶促DNA片段化步骤,因此与机械片段化方法相比,对DNA输入更加敏感。富集的最终成功很大程度上依赖于使用精确定量的输入DNA。因此,准确的gDNA定量是至关重要的。

Illumina建议使用基于荧光的双链DNA (dsDNA)定量方法,如QuantiFluor,并对样本进行三次复制,以获得更可靠的测量结果。避免使用测量总核酸含量的方法(如纳米滴法或其他紫外吸收法)。常见的污染物,如ssDNA, RNA和寡糖,并不是用于Nextera快速捕获富集试验的底物。确保起始DNA中EDTA含量不超过1mm,且无苯酚、乙醇等有机污染物。

Nextera快速捕获富集协议已优化为50 ng总gDNA。高质量的gDNA输入会导致标记不完全和更大的插入尺寸,从而影响富集性能。在标记反应中,较低质量的gDNA输入或低质量的gDNA可以产生比预期的更小的插入尺寸。较小的插入可能会在随后的清理步骤中丢失,从而导致较低的多样性。

为了最小化标记步骤中gDNA样本输入的可变性,Illumina强烈推荐两步gDNA归一化方法。初始定量后,首先将gDNA样品归一化到10ng /ul。然后使用类似的基于荧光法的方法对样品进行重新定量,并归一化为最终的5 ng/ul。