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Nextera Mate Pair协议已通过s系列Covaris超声仪验证。根据Covaris的说法，在使用等效设置时，e系列(E210和E220)的性能应该是相似的(如果使用E210，遵循S2的建议设置;如果使用E220，请参照S220的设置)。然而，这些设置可能不能直接转移，并且按照协议中建议的那样使用s系列之外的Covaris可能需要进行优化。
无凝胶方案的推荐输入为1 μg基因组DNA，从48个样品中生成48个文库。当遵循Gel-Plus协议时，使用4 μg基因组DNA作为输入。这个数量可以为每个样本准备12个具有大小选择的库，也可以为最多48个库，从12个输入中每个输入有4个大小选择。
是的，虽然标记反应可能产生平均插入大小为5 kb或更多的碎片分布，但较小的碎片比较大的碎片更有效地循环。因此，测序数据中检测到的平均片段大小可以比标记反应的生物分析仪电泳图显示的要小得多。
Illumina Nextera Mate Pair Library Preparation Kit的文库分布范围很广，一般在300-1500 bp之间，峰值在600-700 bp左右。为了测序的目的，没有必要进一步选择库的大小。虽然最大的片段可能不能有效地聚类和排序，但它们在库中的存在是无害的。
具有尺寸选择的Nextera配对凝胶+协议旨在生成尺寸分布更窄、中位数片段大小更大的配对库。这是通过使用基于凝胶的大小选择过程来选择所需大小范围的DNA来实现的。具有狭窄碎片分布的Mate Pair库将有助于精确的结构变异检测。它还将通过提供跨越更大重复区域的成对读取信息，帮助简单和复杂基因组的从头组装。
然而，随着片段长度的增加，生成凝胶+文库的难度也随之增加。与具有较小的Mate Pair片段大小的库相比，具有较大片段长度的库预计具有较低的最终库产量和较低的库多样性，并且更具有健壮性。为了在执行Gel-Plus过程时增加库生成的健壮性，对协议中的几个步骤进行了优化，并提供了指导方针。
Nextera Mate Pair Gel-Free协议是一种低输入(1ug)、简单、健壮的协议，它生成的Mate Pair库具有广泛的片段大小分布，从1.5 kb到15 kb，中间插入大小约为3 kb。无凝胶协议可靠地产生具有较少重复的高多样性库，允许对库进行更深层次的排序。无凝胶配对文库可能的应用是从头组装(特别是小基因组)和结构变异检测研究。虽然目前Illumina还不支持无凝胶协议，但该协议也可能适用于自动化。
AMPure的纯化程序已经由Illumina公司使用爱思进最大回收率1.7 ml微离心管和Invitrogen公司的磁支架(CS15000部分)进行了验证，具体请参见用户指南中的消耗品和设备清单。当使用其他微离心管/管格式或其他磁铁时，不能保证类似的性能，如产量和库的大小分布，并且协议可能需要更长时间。
看到Illumina测序平台上Nextera伴侣对读取数据的处理配对结序列。该文档还包含关于如何执行适配器调整和分析Mate Pair数据集的信息。
Nextera Mate Pair工具包采用Nextera和TruSeq技术。输入的gDNA最初被标记为Nextera转座酶，它在DNA分子的末端添加了一个Mate Pair连接适配器。
然而，在循环之后，DNA被第二次碎片化，并添加TruSeq适配器。随后的PCR、聚类和测序步骤使用TruSeq适配器。
因此，出于测序目的，完成的Nextera Mate Pair文库被认为是TruSeq DNA文库，必须使用TruSeq测序引物和协议进行测序。