避免交叉污染
- 一次只能打开一个适配器。
- 吸液时要小心，以免溅出。
- 清洁移液器，在处理不同适配器时更换手套。
- 在手术前后彻底清洁工作表面。
处理RNA
RNA非常容易被RNAse酶降解。RNAse酶存在于细胞和组织中，携带在手、实验室用具和灰尘中。它们非常稳定，很难灭活。由于这些原因，在准备和处理RNA样本时，遵循最佳实验室实践是很重要的:
- 当收集总RNA时，使用一种能够快速破坏组织、分离和稳定RNA的方法。
- 任何时候都要戴手套并使用无菌技术。
- 为RNA工作保留一套移液器。使用无菌的RNAse-free滤嘴，以防止交叉污染。
- 使用经过rnase认证的一次性塑料制品。Illumina建议使用无粘性无菌rnase微灭菌管。应为本方案指定一套这样的试管，不应用于其他实验室工作。
- 所有试剂应采用无rnase组分配制，包括超纯水。
- 冷冻储存RNA样本。避免在协议中延长暂停，直到RNA以双链DNA (dsDNA)的形式出现。
- 在开始本协议之前，使用RNAse/DNAse去污溶液去污工作台和设备。
温度因素
- 保存库的温度应≤37℃。
- 避免过高的温度，特别是在适配器连接之前的步骤。
- 与富含gc的mRNA片段相比，AT含量高的mRNA片段更容易变性成单链，这可能导致在测序覆盖上产生偏差的可能性增加。
- 当适配器被连接到ds-cDNA的末端后，温度就不是什么问题了。
处理液体
- 体积的微小差异(±0.5µl)有时可引起聚类数量的巨大差异(~100,000)。
- 在需要生成标准曲线的方案(如PicoGreen分析或qPCR)或需要小但精确体积的方案(如Agilent生物分析仪)中，小体积移液可能是潜在错误的来源。
- 如果不可避免地要用小体积的移液器，则应采取适当的努力，确保移液器的校准是正确的。
- 确保移液器没有在其性能规格的最大容量下使用。
- 注意高分子量双链DNA (dsDNA)的溶液。它们可能是粘性的和不均匀的分散，导致等分测量不能代表溶液的真实浓度。
- 同时为多个样品准备试剂，以减少移液误差，特别是小体积添加酶时。从体积较大的试剂管中移液一次，而不是用1 μl体积的多次移液。该方法允许您在单个移液移动中对单个样品进行整除，并对多个样品进行标准化。