iSeq上Illumina的AmpliSeq

该资源通过在iSeq 100测序系统上为Illumina转换为AmpliSeq的过程提供逐步指导。

初步考虑

图书馆总准备时间

Illumina AmpliSeq的总库准备时间为5-7小时。实际操作时间<1.5小时,不包括库量化、标准化和池化。

训练

AmpliSeq for Illumina工作流不需要现场培训。如果您对培训感兴趣,请联系您当地的销售代表以了解有关可用课程的信息。

提供以下在线视频课程:

  • Illumina的AmpliSeq:概述
    本课程介绍了用于Illumina分析技术的AmpliSeq,列出了面板的类型,并介绍了amplicon测序工作流程,包括分析amplicon测序数据的选项。
  • 用于Illumina的AmpliSeq:库准备协议
    本课程确定AmpliSeq for Illumina library prep协议所需的项目,介绍多路放大器运行的池规划资源,演示协议中的步骤,并列出最佳实践。

制备样品

兼容的样本类型

用于Illumina的AmpliSeq与可用输入量和质量不受限制的样本兼容,例如血液、细胞培养或新鲜冷冻组织,以及具有挑战性的样本类型,例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。DNA和RNA的输入要求从1纳克到100纳克不等,具体取决于应用需要。对于大多数应用程序,我们建议每个池输入10 ng。

量化样本

DNA纯度的A260/A280比率必须为1.8–2.0。建议使用PicoGreen(DNA)或量子位DNA HS试剂盒进行准确定量。请参阅AmpliSeq面板的参考指南,以确定所需的任何修改。

准备图书馆

所需组件

用于Illumina的AmpliSeq需要用于Illumina面板的AmpliSeq、用于Illumina Library PLUS套件的AmpliSeq以及兼容的AmpliSeq索引套件。Illumina Library PLUS套件的AmpliSeq有24、96和384种反应配置。

有关索引工具包兼容性的信息,请参阅面板的参考指南。

有关所需设备和用户提供耗材的信息,请访问支持页为您的小组。可在每个面板的文档页上找到耗材和设备清单。

规范化

Illumina库的AmpliSeq在池化之前手动标准化。

为测序准备库

库自动变性为单链,并在仪器上进一步稀释。有关更多信息,请参阅中的群集信息和库稀释部分iSeq 100测序系统指南.

样本索引

索引是一种标记生物样本的方法,然后使用生物信息学方法来区分运行期间生成的测序数据。

有关详细信息,请参见中的“成对端流单元格上的双索引工作流”(工作流B)部分索引排序概述指南.

多路复用样本

通过协议一次可处理1–96个样本。但是,建议使用多通道移液管处理8个样本或8个样本的倍数。

选择索引组合

有关支持的索引组合的信息,请参阅索引适配器池指南或者池计算器.

用于Illumina索引适配器序列的AmpliSeq

AmpliSeq for Illumina协议中使用的索引适配器是专门为AmpliSeq for Illumina设计的。适配器具有专有设计和修改。Nextera或TruSeq适配器与此协议不兼容。

请参阅本手册的照明面板部分的AmpliSeqIllumina适配器序列文档对于适配器序列和用于Illumina池指南的AmpliSeq部分索引适配器池指南.

Ion AmpliSeq和AmpliSeq在Illumina库准备协议中的差异

Ion-AmpliSeq协议和AmpliSeq for Illumina协议之间存在一些重要差异,例如增加了放大和清理步骤。要成功使用AmpliSeq for Illumina协议,请查看并遵循AmpliSeq for Illumina参考指南中的说明。

兼容热循环器

有关热循环器的建议,请访问支持页用于照明面板的AmpliSeq。可在每个面板的文档页上找到耗材和设备清单。

iSeq 100系统上Illumina的测序AmpliSeq

合成测序(SBS)技术

有关详细信息,请查看测序:Illumina技术视频或参考下一代测序技术简介.

所需试剂和设备

iSeq 100系统需要iSeq 100 i1试剂盒。有关所需用户提供耗材和设备的信息,请参阅iSeq 100测序系统指南.

有关iSeq 100测序系统的信息

文档培训视频可在iSeq 100测序系统支持页面中找到。

设置序列运行

请参阅中的设置顺序运行(本地运行管理器模式)或设置顺序运行(手动模式)部分iSeq 100测序系统指南.

创建示例工作表

你可以使用iSeq 100系统样本表模板创建样本表。在手动模式下使用BaseSpace Sequence Hub运行监控和存储进行排序时,需要样本表。下载并编辑样本表,然后在运行设置期间将其上载到控制软件。

确定建议的测序深度

最佳排序深度取决于您正在运行的应用程序和您的实验目标。有关适用的参考研究,请参阅文献。

建议读取长度

对于面板的长度和应用,建议使用2x151 bp。

Illumina库的AmpliSeq加载建议

请参阅中的准备序列库和群集生成部分iSeq 100测序系统指南.

PhiX的背景资料

参见技术公告PhiX Control v3库是什么?它在Illumina NGS中的功能是什么?

确定所需的循环次数

请参阅中读取部分的循环数iSeq 100测序系统指南.

在成对末端和单读序列之间选择

成对末端测序允许用户对片段的两端进行测序,并生成高质量、可对齐的序列数据。配对末端测序有助于检测基因组重排和重复序列元件,以及基因融合和新转录本。

因为成对的结束读取更有可能与引用对齐,所以整个数据集的质量会提高。所有Illumina下一代测序(NGS)系统都能够进行配对末端测序。Illumina建议对Illumina库的AmpliSeq进行配对末端测序。

有关更多信息,请参阅Illumina网站以及在系统的成对端流单元(工作流B)部分上的双索引工作流索引排序概述指南.

优化簇密度

提到集群优化概述指南Illumina系统群集密度指南.

图案化流动池

图案化流动池在流动池的两个表面的固定位置包含数十亿个纳米孔。结构化组织提供了均匀的序列簇间距,与非模式簇生成相比具有显著优势。

有关详细信息,请参见阵列流动单元技术网页,视频技术说明.

在iSeq 100系统上分析Illumina的AmpliSeq数据

分析NGS数据

参考序列数据分析中的关键概念介绍网络研讨会,介绍和讨论分析Illumina测序数据时使用的概念和一般方法。本网络研讨会面向Illumina NGS新用户,涵盖从头组装、RNA测序和SNP发现中使用的基本分析方法。网络研讨会还介绍了实验设计的基本概念。

本地运行管理器

本地运行管理器是用于Illumina工作台测序数据的基于Windows的软件,包括本地分析选项、运行和用户管理。

这个本地运行管理器网络研讨会提供本地运行管理器的概述,面向新用户和中间用户。有关详细信息,请查看本地运行管理器支持页面和本地运行管理器概述培训班。

本地运行管理器设备和计算要求可在本地运行管理器软件指南.

有关设置本地运行管理器的信息,请参阅序列文件格式这个用于数据分析网络研讨会的FASTQ处理工具,以及本地跑步经理介绍网络研讨会.

基空间序列集线器

BaseSpace Sequence Hub是基于Illumina云的测序数据分析解决方案。有关运行和项目之间的差异、使用数据以及共享数据等信息,请参阅BaseSpace序列中心网络研讨会. 有关更多信息,请参阅基空间序列集线器支持页面和使用BaseSpace Sequence Hub准备运行培训班。

使用BaseSpace Sequence Hub分析iSeq中的FASTQ文件

请参阅以下资源:

BaseSpace序列中心应用程序

DNA扩增子和RNA扩增子应用程序都可以通过BaseSpace Sequence Hub获得。

图书馆准备的额外资源

测序和分析的额外资源