TruSeq RNA外显子组常见问题

使用10ng高质量的人类通用参考总RNA作为输入。如果从FFPE RNA开始，则根据样本质量输入样本数量。用> 200 nt片段分布值(DV)计算RNA片段百分率₂₀₀)作为FFPE RNA质量的可靠决定因素。

有关更多信息，请参见FFPE样本的RNA质量评估技术报告。

使用荧光分析(例如，RiboGreen或Qubit)来准确定量总RNA输入。要了解更多信息，请参阅参考指南。

使用片段分析仪定量RNA样本。有关更多信息，请参见FFPE样本的RNA质量评估．

通过Illumina可以订购以下库准备、充实、面板和索引适配器组件。在Illumina，根据您的实验的样本数量订购索引适配器组件。

编码外显子组寡核苷酸(CEX)

TruSeq RNA Access Library Prep协议中有8个安全的停止点:

1. 在-25°C至-15°C条件下合成第二链cDNA 7天
2. 在-25°C至-15°C下连接适配器长达7天
3. 第一次PCR扩增后-25°C至-15°C可达7天
4. 库验证后，在-25°C至-15°C长达7天
5. 在-25°C到-15°C的第一次捕获后长达7天
6. 捕获样品后，在-25°C至-15°C清洗多达7天
7. 第二次PCR扩增后，在2°至8°C条件下持续2天
8. 第二次PCR后，在-25°C至-15°C下清理7天

要了解更多信息，请参阅参考指南。

从总RNA输入开始，8-16个样本需要2天，17-48个样本需要3天，直到库准备加载到流细胞上。这包括大约11个小时的动手时间。

该试剂盒类似于TruSeq链总RNA库Prep，因为它可以从低质量和ffpe衍生的样本中进行RNA测序，并保持链信息。与TruSeq strand Total RNA Library Prep不同，该试剂盒只捕获转录组的编码区域，允许更高的吞吐量和更低的测序深度。

该试剂盒类似于TruSeq链mRNA Library Prep，因为它提供编码RNA的测序，不需要核糖体耗竭。

该试剂盒与低质量和ffpe衍生的样品兼容，因为它不依赖poly-A尾的存在。

该试剂盒有a组和B组，各包含12项指标。当一起使用时，集合A和B总共提供24个唯一索引。

使用安捷伦技术人类UHR总RNA(目录# 740000)作为本协议的对照样本。UHR包含以下已知融合:BCR-ABL1、BCAS3-BCAS4和NUP214-XKR3(低水平)。

使用片段分析仪或生物分析仪量化库。另外,使用PicoGreen。

因为它丰富了编码转录组，核糖体RNA在洗涤过程中被冲走。

当一起使用时，TruSeq RNA单指数集A和B允许使用每个试剂盒中的12个不同指标汇集多达24个样本。

每个RNA库使用200 ng。

你可以一次准备一个样品。

最终产品的尺寸为~250 ~ 300 bp。对于好的FFPE RNA (> 350 nt)，片段的大小预计会更大，而对于差的FFPE RNA，片段的大小预计会更小。

使用NGS片段分析试剂盒的Advanced Analytical Technologies Fragment Analyzer或使用DNA 1000芯片的Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer评估最终文库的质量。

使用qPCR对文库进行定量。有关更多信息，请参见测序库qPCR定量指南．

所有Illumina测序平台，除HiSeqX。

需要群集生成试剂盒中包含的标准测序引物。

推荐的读取长度为2 × 75 bp。

BaseSpace Sequence Hub的RNA核心应用程序包括行业标准TopHat和Cufflinks分析管道。另外，第三方分析工具也可用。

各种数据文件和图组成了分析TruSeq RNA Access库的输出。有关详细信息,请参见用于RNA测序的BaseSpace Core应用程序．

Illumina提供RNA的BaseSpace应用程序。看到BaseSpace应用．