最佳实践
避免交叉污染
- 每次只打开一个适配器管。
- 当使用含有DNA适配器板(DAP)的试剂盒时，用无菌70%乙醇擦拭器清洁96孔PCR板或用于刺穿DAP箔密封的八管条的底部。
- 小心移液，避免溢出。
- 清洁移液器和更换手套在处理不同的适配器股票。
- 在操作前后彻底清洁工作表面。
避免潜在的DNA污染物
- 由由样品中的多余核酸干扰引起的DNA污染可能导致不正确的DNA定量，所述DNA污染（例如RNA，小核酸片段，核苷酸，单链DNA），过量蛋白质或其他污染物。
- DNA质量也可能影响样品中可用DNA的数量。如果DNA被损坏(例如，严重的缺口或含有大量的无嘌呤/无嘧啶位点)，那么许多这些片段可能在文库准备过程中失效。
- 源自宿主基因组的高分子量dsDNA也可以干扰精确定量。尽管最佳净化努力，细菌人工染色体（BAC）和其他细菌衍生的质粒通常含有来自宿主细胞的染色体DNA的小百分比。这些序列最终可能导致流动细胞通道上的不需要的簇。然而，通过分析在针对已知的细菌序列的测序期间产生的对齐的读取并减去这些污染并减去这些污染并减去这些污染。在库制备之前也可以估计高分子量污染，所述QPCR测定设计用于靶向独特的染色体标记物。
温度因素
- 在温度≤37°C下保持文库，除了具体说明。
- 将试剂在室温下解冻后置于冰上。
- 避免高温，特别是在适配器连接之前的步骤中，除了具体说明。
- 当手动处理超过48个样品时，Illumina建议在可能的情况下在冰床上处理盘子，特别是在酶的步骤(当使用末端修复混合，a -尾端混合，和结扎混合)。大量的样品在室温下加工可能会导致催化活性不均匀，从而导致最终产品质量下降。
- 具有高于含量高的DNA片段比GC的片段更容易变成单链，这可能导致在测序覆盖范围内产生偏差的可能性增加。
- 注意不要在琼脂糖凝胶电泳过程之前使文库变性，因为单链DNA有不同的迁移率。
处理液体
- 体积的小差异（±0.5μl）有时会产生簇数（〜100,000）的非常大的差异。
- 在需要生成标准曲线的协议中，如PicoGreen分析或qPCR，或那些需要小但精确的体积，如安捷伦生物分析仪，小体积移液可能是潜在错误的来源。
- 如果小卷是不可避免的，则应采取尽职调查以确保液化液相识。
- 确保移液器没有在其性能规格的体积极限下使用。
- 注意高分子量双链DNA（DSDNA）的溶液。这些可以是粘性的并且没有均匀分散，导致等分试样的测量不是代表溶液的真正浓度的等分试样测量。
- 同时为多个样品准备试剂，以最大限度地减少移液误差，尤其是添加少量酶时。移液一次从试剂管中以更大的体积，而不是在1 μl体积下多次移液。这种方法允许你在单个样品的移液移动中进行计算，并对多个样品进行标准化。
处理主混合物试剂
- 最小化冻融周期。如果您不打算一次使用试剂，则在初始解冻后将试剂分配到等分试样中，以避免过量的冻融循环。但是，如果你等分，你可能没有足够的试剂，以获得多种用途的全部反应。
- 在指示的顺序中添加试剂，避免制作包含在线控制的主混音。
- 由于试剂的粘度，在添加ATL（尾标混合物）和LIG（连接混合物）的同时注意。
处理磁珠
使用SPB或AMPURE XP珠子时遵循适当的处理方法：
- 在使用之前，让珠子达到室温。
- 不要重用珠子。在进行程序时总是添加新鲜珠子。
- 在使用前，立即将珠子旋涡，直到它们很好地分散。液体的颜色应均匀。
- 当执行低样本协议时:
- 将微珠加入反应后，通过上下移液10次，轻柔彻底地混合溶液，确保液体与微珠接触，微珠再悬浮均匀。
- 用底端移液，而不是整个溶液的体积，有助于防止溶液起泡。过度发泡导致样品损失，因为泡沫不能有效地转移出板。
- 在进行高样品方案时，在将珠子添加到反应后，密封板并在1,800 rpm下将板上摇动板在噬粒振荡器上2分钟。如有必要，重复，直到混合后混合物的颜色出现均匀。
- 注意尽量减少珠子的损失，这会影响最终的产率。
- 更改每个示例的提示。
- 让混合样品在室温下孵育，以便在协议中规定的全部持续时间，以确保最大恢复。
- 当从反应板和清洗步骤中抽吸清除的溶液时，重要的是要保持反应板在磁架上，不要干扰分离的磁珠。缓慢吸入，以防止珠滑下孔的侧面，并进入移液管的尖端。
- 为了防止洗脱后珠子的携带，当从珠粒沉淀中除去洗脱液时，留下约2.5μl上清液。
- 根据方案要求，随时准备新鲜的70%和/或80%乙醇。乙醇倾向于从空气中吸收水分，因此，应准备新鲜的70%和/或80%的乙醇以达到最佳效果。
- 一定要从井底除去所有乙醇，因为它可能含有残留的污染物。
- 将反应板保持在磁场上，使其在室温下风干，以防止由于静电力引起的电位胎圈损失。允许完全蒸发残留的乙醇，因为乙醇的存在会影响随后的反应的性能。Illumina建议SPB珠子的干燥时间至少为8分钟，为Ampure XP珠子的15分钟干燥时间，但可能需要更长的干燥时间。剩余的乙醇可以用10μL移液管除去。
- 再悬浮缓冲液(RSB)用于DNA洗脱。
- 避免过度干燥，否则会影响最终产量。
- 当执行低样本方案时，使用单通道或多通道移液管重新悬浮干燥的颗粒。
- 当执行高采样方案时，通过摇晃重新悬浮干燥的颗粒。
- 从井中去除和丢弃上清液时，使用单个通道或多通道移液管，并注意不要打扰珠子。
- 为了在洗脱过程中最大限度地提高样品回收率，将DNA/珠子混合物在室温下孵育2分钟，然后将样品放在磁铁上。