最佳实践
避免交叉污染
- 一次只打开一个适配器管。
- 使用含有DNA适配器板（DAP）的试剂盒时，清洁96孔PCR板或八管条的底部，用于刺穿具有无菌70％乙醇擦拭物的DAP的箔密封。
- 仔细吸移液以避免溢出。
- 干净的移液器和处理不同适配器股之间的换手套。
- 在手术前后彻底清洁工作曲面。
避免潜在的DNA污染物
- 错误的DNA定量可能是由于样品中多余的核酸(如RNA、小核酸片段、核苷酸、单链DNA)、多余的蛋白质或其他污染物质的干扰造成的DNA污染。
- DNA质量也可能影响样本中可用DNA的数量。如果DNA受损(例如，严重损伤或包含大量的无嘌呤/无嘧啶位点)，那么许多这些片段可能在文库制备过程中失败。
- 来自宿主基因组的高分子量dsDNA也会影响准确的定量。细菌人工染色体(BACs)和其他细菌来源的质粒通常包含一小部分来自宿主细胞的染色体DNA，尽管做了最好的纯化工作。这些序列最终可能在流胞道上产生不必要的簇。然而，这种污染可以通过对已知细菌序列进行测序时产生的比对reads进行分析并将其减去来精确量化。高分子量污染也可以在文库制备前使用qPCR检测方法进行评估，该方法旨在针对独特的染色体标记物。
温度考虑因素
- 除特别注明的地方外，保持库的温度在≤37°C。
- 在室温下解冻后将试剂放在冰上。
- 避免高温，特别是在连接适配器之前的步骤中，除非特别注明。
- 当手动处理超过48个样品时，Illumina建议尽可能在冰床上加工板，特别是在酶促步骤（使用最终修复混合物时，尾翼混合和结扎混合物）。在室温下加工的大量样品可能导致催化活性不均匀，这可能导致最终产品的质量降低。
- 具有高AT含量的DNA片段比富含gc的片段更有可能变性为单链，这可能导致在测序覆盖范围中产生偏差的可能性增加。
- 注意不要在琼脂糖凝胶电泳过程之前使文库变性，因为单链DNA有不同的迁移速率。
处理液体
- 体积的微小差异(±0.5µl)有时会导致聚类数的巨大差异(~100,000)。
- 小体积移液可以是需要产生标准曲线的协议中的潜在误差的来源，例如Picogreen测定或QPCR，或需要小但精确的体积的那些，例如安捷伦生物分析仪。
- 如果小容量是不可避免的，那么应该采取尽职调查，以确保移液器被正确校准。
- 确保在其性能规格的极端音量下不使用移液器。
- 注意高分子量双链DNA (dsDNA)的溶液。这些物质可能是粘性的，不均匀地分散，导致测量结果不能代表溶液的真实浓度。
- 同时制备多个样品的试剂以最小化移液误差，特别是小体积酶添加剂。移液管从具有较大体积的试剂管，而不是1μL体积的多次。该方法允许您在单个移液运动中等分于各个样本并跨多个样本标准化。
处理主混合试剂
- 减少冻融循环。如果您不打算一次性使用试剂，请在初始解冻后将试剂分配到等量溶液中，并重新冷冻等量溶液，以避免过度的冻融循环。然而，如果你分装，你可能没有足够的试剂用于多个用途的全部反应。
- 按照指示的顺序添加试剂，避免制作包含在线控制的主混合。
- 加入ATL (a -尾砂混合物)和LIG(连接混合物)时要小心，因为试剂的粘度。
处理磁珠
使用SPB或AMPure XP珠子时，遵循适当的处理方法:
- 在使用之前，请允许珠子进入室温。
- 不要重复使用珠子。在做手术的时候一定要加入新鲜的珠子。
- 在使用前，立即将珠子旋涡，直到它们很好地分散。液体的颜色应均匀。
- 当执行低样本协议时:
- 在反应中加入珠子后，通过向上和向下移动10次，使液体轻轻地和彻底混合，确保液体与珠子接触，并且均匀地重新悬浮珠子。
- 用井底的尖端移液而不是移液整个体积有助于防止溶液起泡。过度发泡导致样品损失，因为泡沫不能有效地转移出板。
- 当执行高样品程序时，在将小球加入反应后，密封板并在微孔板摇床上以1800转/分的速度摇板2分钟。如有必要，重复此步骤，直到混合后的混合物颜色均匀。
- 注意尽量减少可能影响最终产量的珠子损失。
- 更改每个示例的提示。
- 将混合样品在室温下培养至方案规定的全部时间，以确保最大限度的恢复。
- 当从反应板和洗涤步骤中吸出所清除的溶液时，重要的是将板保持在磁台上并不干扰分离的磁珠。缓慢吸气以防止珠子在井的侧面滑动并进入移液管尖端。
- 为防止洗脱后微珠的携带，当洗脱物从微珠颗粒中除去时，约留下2.5 μl的上清液。
- 按照协议要求，总是准备70%和/或80%的新鲜乙醇。乙醇易于从空气中吸收水分，因此，应准备70%和/或80%的新鲜乙醇以获得最佳结果。
- 一定要清除井底的所有乙醇，因为它可能含有残留的污染物。
- 将反应板放在磁支架上，在室温下风干，以防止静电造成的磁珠损耗。允许残余乙醇完全蒸发，因为乙醇的存在将影响后续反应的性能。Illumina建议SPB珠至少8分钟的干燥时间，AMPure XP珠至少15分钟的干燥时间，但可能需要更长的干燥时间。用10 μl移液管去除剩余的乙醇。
- 使用重悬浮缓冲液（RSB）进行DNA洗脱。
- 避免过度干燥，这会影响最终产量。
- 当执行低样品方案时，使用单个通道或多通道移液管重悬干颗粒。
- 当执行高采样方案时，通过摇动重新悬浮干燥颗粒。
- 当从井中清除和丢弃上清液时，使用单通道或多通道移液管，注意不要干扰珠。
- 为了在洗脱过程中最大限度地提高样品回收率，在将样品放在磁铁上之前，将DNA/珠混合在室温下孵育2分钟。