输入要求

Illumina推荐1µg输入DNA。

输入DNA定量

正确定量的基因组DNA是必要的。文库准备的最终成功或失败很大程度上取决于使用准确定量的输入DNA。

Illumina建议使用基于荧光的定量方法，包括Qubit或PicoGreen，为dsDNA提供准确的定量。基于紫外光谱的方法，如Nanodrop，将测量样品中存在的任何核苷酸，包括RNA, dsDNA, ssDNA，和游离核苷酸，这可以给出一个不准确的gDNA测量。

DNA定量方法依赖插层荧光染料只测量dsDNA，较少受过量核酸的影响。然而，这些方法需要制备校准曲线，并且对移液误差高度敏感。确保移液器被正确校准，并且没有在其性能规格的体积极值下使用。

DNA质量评估

在260 nm处的吸光度测量通常用于评估DNA质量。使用以下指南:

• 以260 nm吸光度与280 nm吸光度之比作为样品纯度的指标;1.8 ~ 2.0表示DNA相对纯。
• RNA或小核酸片段(如核苷酸)的存在会影响吸光度测量。
• 仔细收集基因组DNA样本，确保它们没有污染物。

凝胶电泳是揭示样品中DNA存在与否的有力手段。只要有可能，用凝胶来评估DNA样本的状况。使用以下指南:

• DNA条带的涂抹表明有杂质，如洗涤剂或蛋白质。
• 干扰260nm读数的RNA通常在凝胶的底部可见。
• 一个梯子或涂片下面的兴趣带可能表明刻痕或其他损害的DNA。