最佳实践
避免交叉污染
- 一次只打开一个适配器。
- 小心移液，避免溢出。
- 当使用包含RNA适配器板(RAP)的试剂盒时，用无菌70%乙醇擦拭96孔PCR板或用于刺穿RAP铝箔密封的八管条带的底部。
- 清洁移液器和更换手套在处理不同的适配器股票。
- 在操作前和操作后彻底清洁工作表面。
处理RNA
RNA非常容易被RNAse酶降解。核糖核酸酶存在于细胞和组织中，并随手、实验室设备和灰尘携带。它们非常稳定，很难失活。由于这些原因，在准备和处理RNA样本时遵循最佳实验室做法是很重要的:
- 在获取总RNA时，使用一种快速破坏组织、分离和稳定RNA的方法。
- 任何时候都要戴上手套并使用无菌技术。
- 在开始本协议之前，使用RNAse/DNAse去污溶液去污工作表面和设备。
- 为RNA工作保留一套移液管。使用无菌无rnase滤嘴，以防止交叉污染。
- 使用经认证不含rnase的一次性塑料制品。Illumina推荐使用不粘的无菌无rna微通气管。一套这样的管道应该被指定为本协议，不应该用于其他实验室工作。
- 所有试剂都应由不含rnase的组分制备，包括超纯水。
- 将RNA样本冷冻保存。在协议中避免长时间的停顿，直到RNA以双链cDNA (ds cDNA)的形式出现。
温度因素
- 除非协议中有特别说明，否则库的温度应保持在≤37°C。
- 试剂在室温下解冻后，置于冰上。
- 当手动处理超过48个样品时，Illumina建议在可能的情况下在冰床上处理盘子，特别是在酶的步骤(当使用a -尾迹混合和结扎混合时)。大量样品在室温下加工可能导致催化活性不均匀，从而导致最终产品质量下降。
- 具有高AT含量的mRNA片段比富含gc的片段更有可能变性为单链，这可能导致在测序覆盖范围中产生偏差的可能性增加。
- 当接合器连接到ds cDNA的末端后，温度就不再是一个问题了。
处理液体
良好的液体处理措施是必要的，特别是当定量库或稀释浓缩库以制造集群时。
- 体积的微小差异(±0.5µl)有时会导致聚类数的巨大差异(~100,000)。
- 在需要生成标准曲线的协议中，如PicoGreen分析或qPCR，或那些需要小但精确量的协议中，如安捷伦生物分析仪，小体积移液可能是潜在错误的来源。
- 如果小容量是不可避免的，那么应该采取尽职调查，以确保移液器被正确校准。
- 确保移液器不是在其性能规格的音量极限下使用的。
处理主混合试剂
- 减少冻融循环。如果您不打算一次性使用试剂，请在初始解冻后将试剂分配到等量溶液中，并重新冷冻等量溶液，以避免过度的冻融循环。然而，如果你分装，你可能没有足够的试剂用于多个用途的全部反应。
- 按照指示的顺序添加试剂，避免使主混合中包含在线控制。
- 加入ATL (a -尾砂混合物)和LIG(连接混合物)时要小心，因为试剂的粘度。
- 一些RNA试剂盒含有第一链合成混合Act D (FSA)，其中含有放线菌素D，一种毒素。人身伤害可通过吸入、摄入、皮肤接触和眼神接触而发生。按照当地政府的安全标准处理容器和任何未使用的内容。请以产品为准物料安全数据表(MSDS)获取详细的环境、健康和安全信息。
处理磁珠
使用AMPure XP和RNAClean XP珠子时，遵循适当的处理方法:
- 在使用之前，让珠子达到室温。
- 不要重复使用珠子。在做手术的时候一定要加入新鲜的珠子。
- 在使用前，立即将珠子旋涡，直到它们很好地分散。液体的颜色应均匀。
- 当执行低样本协议时:
- 将小球加入反应后，通过上下移液10次，轻轻彻底混合溶液，确保液体与小球接触，并使小球均匀地重新悬浮。
- 用井底的尖端移液而不是移液整个体积有助于防止溶液起泡。过度发泡导致样品损失，因为泡沫不能有效地转移出板。
- 当执行高样品程序时，在将小球加入反应后，密封板并在微孔板摇床上以1800转/分的速度摇板2分钟。如有必要，重复此步骤，直到混合后的混合物颜色均匀。
- 注意尽量减少珠损，因为珠损会影响最终产量。
- 更改每个示例的提示。
- 将混合样品在室温下培养至方案规定的全部时间，以确保最大限度的恢复。
- 当从反应板和洗涤步骤中吸出清除的溶液时，重要的是要将反应板保持在磁支架上，不要干扰分离出的磁珠。缓慢吸气，以防止珠子从吸液孔的侧面滑落到移液器尖端。
- 为防止洗脱后微珠的携带，当洗脱物从微珠颗粒中除去时，约留下2.5 μl的上清液。
- 按照协议要求，总是准备70%和/或80%的新鲜乙醇。乙醇易于从空气中吸收水分，因此，应准备70%和/或80%的新鲜乙醇以获得最佳结果。
- 一定要清除井底的所有乙醇，因为它可能含有残留的污染物。
- 将反应板放在磁支架上，在室温下风干，以防止静电造成的磁珠损耗。允许残余乙醇完全蒸发，因为乙醇的存在将影响后续反应的性能。Illumina建议至少15分钟的干燥时间，但可能需要更长的干燥时间。用20 μl移液管去除剩余的乙醇。
- 用洗脱缓冲液(ELB)洗脱RNA。
- 避免过度干燥，这会影响最终产量。
- 当执行低样本方案时，用单通道或多通道移液管重新悬浮干燥颗粒。
- 当执行高采样方案时，通过摇动重新悬浮干燥颗粒。
- 当从井中清除和丢弃上清液时，使用单通道或多通道移液管，注意不要干扰珠。
- 为了在洗脱过程中最大限度地提高样品回收率，在将样品放在磁铁上之前，将DNA/珠混合在室温下孵育2分钟。