总RNA输入
- 该方案优化为10-100 ng的人总RNA。
- 低剂量可能导致低产量和降低敏感性。
- 使用NanoDrop测定FFPE RNA浓度。
- 该方案已经用10 ng高质量的人类通用参考总RNA作为输入，20-100 ng从FFPE中提取的总RNA进行了测试。
- 使用其他组织的RNA或较低质量的RNA可能需要进一步优化以确定输入量。
- 对于FFPE或降解的样品，确定RNA起始材料的质量，然后计算DV200确定输入。
- 使用安捷伦RNA 6000纳米试剂盒或高级分析标准灵敏度RNA分析试剂盒来确定您的起始材料的质量。
- 退化或FFPE RNA比全长RNA短。
- DNA污染导致对RNA使用量的低估。
- 如果从FFPE RNA开始，样品的输入量取决于样品的质量。利用RNA片段百分率> 200 nt片段分布值(DV200)作为FFPE RNA质量的可靠决定因素。
- 该方案已经用从FFPE中提取的20-100 ng总RNA作为输入进行了测试。以下为FFPE RNA (20-100 ng)的输入建议，作为样本特异性优化的指南。
高 |
> 70% |
20 ng |
媒介 |
50 - 70% |
20 - 50 ng |
低 |
30-50％ |
50 - 100 ng |
太退化 |
< 30% |
不推荐 |
- 为了成功的文库准备，使用RNA分离方法，包括一个反交联步骤和DNase1处理，如QIAGEN RNeasy FFPE Kit或QIAGEN AllPrep DNA/RNA FFPE Kit。
- 对于接近于质量分类的样本，宁可选择输入推荐值的高端。
- 低质量的FFPE样品可能会得到较差的结果。
控制
使用安捷伦公司人类UHR总RNA(目录# 740000)作为本协议的对照样本。