TruSight One文库制备采用酶促DNA片段化步骤，因此与机械片段化方法相比，对DNA输入更加敏感。富集的最终成功很大程度上依赖于使用精确定量的输入DNA。因此，准确的gDNA定量是至关重要的。
Illumina建议使用一种针对双链DNA (dsDNA)的基于荧光测定的方法对起始gDNA进行定量，并将样本重复三次，以获得更可靠的测量结果。应避免使用测量核酸总量的方法(例如纳米滴或其他紫外吸收方法)，因为常见的污染物，如ssDNA、RNA和寡核苷酸不是TruSight One测序面板的底物。
TruSight One协议已优化为50 ng总gDNA。高质量的gDNA输入可能导致标记不完全和更大的插入尺寸，从而影响富集性能。相反，在标记反应中，低质量的gDNA输入或低质量的gDNA可能产生小于预期的插入尺寸，在随后的清理步骤中会丢失，从而导致较低的多样性。
为了最小化标记步骤中gDNA样本输入的可变性，Illumina强烈推荐两步gDNA归一化方法。首次定量后，gDNA样品首先归一化至10 ng/μl。然后使用类似的基于荧光法的方法重新定量样品，并归一化为最终5 ng/ul。