两个RNA文库制备试剂盒的故事

はじめに

拉斐尔·卡洛杰罗は、トリノ大学分子生物技术与健康科学部の副教授で、メンバー5.名で構成される研究グループ生物信息学和基因组学股のリーダーです。このグループでは、バイオマーカーを特定し、がんやその他の多因子疾患の分子基盤を調べるために、ゲノムデータおよびトランスクリプトームのデータマイニングに取り組んでいます。このグループは、独自のソフトウェアアプリを設計し五、基地空间™ 序列集线器を使用して、核糖核酸シーケンス（RNA序列）データの解析を行い、シーケンスサービスや専門家によるバイオインフォマティクスサポートサービスを他の研究グループに提供しています。

ゲノムデータやトランスクリプトームデータの解析におけるスペシャリストとして,Calogero教授はRNAデータがどのように生成されるかに関心を持っています。ラボの業務を効率化する新しい方法を求めて,TruSeq RNA访问图书馆准备装备*とTruSeq RNA图书馆准备工具包を比べてみました。NextSeq™500システム^__でシーケンスを実施し、データはオープンソースソフトウェアで解析するために基空间序列集线器にストリーミングしました。

iCommunityは,バリアント検出,融合検出,および環状RNA解析のRNAライブラリー調製のために,この研究結果からどのような情報が得られるのかについてCalogero教授にお話を伺いました。

拉斐尔Calogeroは,トリノ大学分子生物技术和健康科学系副教授のです。

質問：グループの研究フォーカスを教えてください。

拉斐尔Calogero教授(以下RC):私たちは,がん研究およびバイオマーカー探索に取り組んでいます。また,薬物応答や患者層別化のための希少疾患関連バイオマーカーの発見に焦点を当てたプロジェクトも複数進めています。例えば,alaska airlines阻害薬クリゾチニブへの耐性に関与する遺伝子を特定するための研究が現在進行中です。また白血病バイオマーカーの特性解析研究で細胞外小胞RNAについても調べています。

これらすべての研究で私たちが主に使用している方法は差次的遺伝子発現解析です。またアイソフォームの差次的発現解析、融合検出、および環状核糖核酸検出も使用しています。

質問:RNA-Seq研究ではどのようなシーケンスシステムやデータ解析ソフトウェアを使っていますか吗?

RC:500年RNA-Seq研究ではNextSeqシステムを使っています。500年NextSeqシステムは私のチームに最適なサイズです。実験を動的にセットアップできる柔軟性があります。週を通して常に使用されている状態です。

データ解析にはオープンソースソフトウェアを使っており、主に使うのがR¹やPython²です。データ解析用のスクリプトもデザインしています。私のチームでは主にがん研究を行っているため,DNAデータやRNAデータの準備はBroad研究所基因组分析工具包(GATK)^3.のベストプラクティスに従って行い,バリアントコールにはBroad研究所のMuTect⁴ソフトウェアを使っています。威康中心の鸭嘴兽⁵バリアントコーラーを使って哑巴の結果を集約しています。

「RNA存取」により、バリアントコール、融合検出、および環状核糖核酸検出のためのライブラリー調製を単一の手法に集約させることができます。」

質問:なぜRNAライブラリー調製プロトコールの比較試験を実施しようと思い立ったのですか吗?

RC:我々は、単一の手法にライブラリー調製を集約させてラボの効率を改善する方法を探していました。TruSeq RNA访问库准备工具包がコーディング核糖核酸をターゲットとする方法はエクソームシーケンスと似ています。バリアントコールでは、ポリアデニル化された（polyA）RNA種をターゲットとするTruSeq RNA文库准备工具包に対し、RNA访问キットが同等またはそれ以上の性能を発揮するのではないかと思ったのです。この比較試験の範囲を拡大して、通常は波利亚キャプチャーデータで実施される融合検出や、通常は总核糖核酸ライブラリー調製が必要な環状核糖核酸解析に対するRNA访问データの適合性も評価することにしました。

質問：TruSeq-RNA通路とTruSeq RNA库准备のデータ比較試験はどのように実施したのですか？

RC:イルミナの加里·施罗斯博士のラボから、TruSeq RNA访问库准备工具包、TruSeq RNA库准备工具包、および总核糖核酸調製を用いて得られた乳腺がん（MCF7）細胞株の核糖核酸シーケンスを提供していただきました。すばらしいカバレッジのデータを提供していただいたので、比較試験を効率的に行うことができました。データ解析は、2.段階モードの明星⁶マッピングなどのオープンソースソフトウェアを用いて、盖特のベストプラクティスに従って実施しました。他の研究者に私たちの方法を検証してもらえるようにしたかったので、ラボ独自のバイオインフォマティクスツールは使用しませんでした。

質問：比較試験の結果はどうでしたか？

RC:サンプルあたり2000 ~ 2500年万リードという低いインプットリードレベルでは,聚(によるTruSeq RNA图书馆准备のデータを用いるより,RNA访问のデータを用いる方がより多くのバリアントを検出できることを確認しました。リードレベルが高くなるに伴い,各データライブラリーで検出されたバリアント数の差は小さくなり,1億リード付近ではゼロになりました。

またオフターゲットの量については,聚(データよりもRNA访问データでかなり少なくなっていることも確認しました。聚(データでは多数のリードが遺伝子間領域に局在化していましたが,RNA访问データではそのような局在化は確認されませんでした。これはRNA访问法がコーディングエクソンシーケンスを用いてデザインされているからであり,そのためインプットリードが比較的少ない場合にはバリアント検出において聚よりも効率的なのです。

「基地空间」アプリにより、バイオインフォマティクス初心者でも複雑な解析を簡単に行うことができ、実行された解析ステップを追跡することが可能になります。」

質問:RNAライブラリー調製キットを選ぶ際の注意点などはありますか吗?

RC:RNA访问はサンプルあたり2000 ~ 2500年万リードの標準的な遺伝子レベルの解析フォーマットではバリアント検出において聚よりも効率的になるでしょう。ただし,コーディングエクソン外にあるバリアントを調べる場合には聚の方が適していることが明らかです。コーディングエクソン外の領域は特にRNA访问ではカバーされていませんので。

またRNA访问法で実現するライブラリー調製の高い柔軟性も考慮すべきでしょう。例えば,私たちが融合データを調べていたとき,インプットレベルが低い場合でもRNA访问データと聚データで同じ数の融合転写産物を確認しました。つまり,聚(キャプチャーでは対応できない分解サンプルにおける融合遺伝子の検索にRNA访问を使用できるということです。

もう一つの有益な知見は,通常总RNA調製が必要になる環状RNA同定もRNA访问で可能であったことでした。つまりRNA访问により,バリアントコール,融合検出,および環状RNA検出のためのライブラリー調製を単一の手法に集約させることができるのです。RNA访问には聚よりも少し高価であるというデメリットはありますが,検出できるRNAの種類に関して高い柔軟性が得られます。聚(とは異なり,さまざまな品質のRNAサンプルを標準化できる方法でもあるのです。

質問:これらのRNAライブラリー調製法を使用する前に知っておくべき特別な状況はありますか吗?

RC:まれな場合ですが,コーディング遺伝子とノンコーディング遺伝子が同じ鎖に局在していることがあります。共通領域の一部を共有しているのですが,エクソンとイントロンは完全には重複していません。このような場合,同じ鎖のコーディング・ノンコーディング領域にある特定のエクソンにリードを割り当てるかもしれません。周辺の配列を見て推測しない限り,コーディング領域にもノンコーディング領域にもリードを正しく割り当てることができないかもしれません。

RNA访问データと波利亚データでは同じ数の融合転写産物を確認しましたが、特定の融合転写因子を検出できるかどうかは核糖核酸ライブラリー調製にかかっていました。MCF7は非常によく調べられているため、発表された検証済み融合イベントをすべて収集しました。RNA访问データと波利亚データにおける検索では雅法⁷を使用しました。核糖核酸のテクニカルレプリケートから始めたため、唯一の違いはライブラリー調製でした。両方のデータセットで検出された融合もありました。しかし、その他の融合はどちらか一方のデータセットでしか確認されませんでした。融合転写産物の検出において、ある核糖核酸ライブラリー調製法が別の方法より優れているかどうかを判断するのは困難です。両者は互角だと思います。

質問:研究の次のステップは吗?

RC:現在、このTruSeq-RNA通路とTruSeq RNAのライブラリー調製比較試験についての論文発表に向けて執筆しています。他の研究者もすぐにこの試験を詳細に検討する機会が得られればと思っています。

クリゾチニブ阻害剤研究については、同じサンプルから得られたRNA序列データ、エクソームデータ、そして微小RNAデータを調べています。リンパ腫細胞がクリゾチニブ感受性からクリゾチニブ耐性へと変化する過程で何が起こっているのかを確認するためにRNA访问を使っています。RNA访问を使うことで、発現したバリアントをエクソームレベルのデータと関連付け、どれが機能性タンパク質に影響を及ぼしているのかを判断することができます。

白血病バイオマーカー特性解析研究では,急性リンパ性白血病(所有),急性骨髄性白血病(AML),慢性リンパ性白血病(CLL)およびその他の白血病の何百ものサンプルに関するデータを持っています。RNA細胞外トランスクリプトームと患者の病歴との間の潜在的な関係を見出そうとしています。

質問：他の研究者たちは教授のチームのバイオインフォマティクスに関する知識とノウハウをどのように利用できるでしょうか？

RC:基空间序列集线器では、私たちのバイオインフォマティクスにおける経験を効果的に共有できます。基空间序列集线器には微RNA解析用基地空间アプリがすでに1.つ入っており、さらに2.つが近々公開されます。現時点で環状核糖核酸検出用のアプリはありません。しかし、西里⁸ソフトウェアを組み込んだアプリを1.つ開発しており、公開に向け基空间序列集线器に提出済みです。

これらのBaseSpaceアプリは,バイオインフォマティクスの専門家でなくても私たちがラボで開発した解析を再現できるようにデザインされています。BaseSpaceアプリにより,バイオインフォマティクス初心者でも複雑な解析を簡単に行うことができ,実行された解析ステップを追跡することが可能になります。もう一つの利点としては,BaseSpaceアプリではローカルインフラの構築が不要だということです。ユーザーは,実施している実験に必要なコンピューティングリソースにアクセスできます。

私たちは基空间序列集线器を、イタリアやシンガポールの生物学者向けのゲノムトランスクリプトームデータ解析コースでの教育ツールとして使用しています。また、ドイツでは欧洲分子生物学实验室（EMBL）で使用しています。基空间序列集线器の最も目を引く特長の1.つは直感的なインターフェースです。ウェットラボの科学者に使ってもらうと、解析スクリプトを書かなければならないため作業が脱線するということがありません。その分、解析ステップの理解に集中できるのです。基空间序列集线器を使えば、どのように行うかではなく、何のために行っているのかという生物学的理由にもっと焦点を当てることができるのです。

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