为NGS工作流程做准备
在开始下一代测序工作流程之前，分离和纯化你的核酸。一些DNA提取方法可以引入抑制剂，这可能会对发生在NGS工作流程中的酶反应产生负面影响。为了获得最好的结果，使用针对你的样本类型优化的提取方案。在RNA测序实验中，通过逆转录将RNA转化为cDNA。
采油后，大多数NGS工作流程都需要一个QC步骤。我们建议用紫外分光光度法进行纯度评估，用荧光法进行核酸定量。
NGS工作流程中的第一步:图书馆准备
库的准备工作对于NGS工作流程的成功至关重要。这一步准备DNA或RNA样本，以兼容测序。测序库通常是通过将DNA片段化并在两端添加专门的适配器来创建的。在Illumina测序工作流程中，这些适配器包含互补序列，允许DNA片段与流动细胞结合。片段可以扩增和纯化。
为了节省资源，可以将多个库集中在一起，并在同一个运行过程中进行排序，这个过程称为多路复用。在适配器连接期间，唯一的索引序列或“条形码”被添加到每个库中。这些条形码用于在数据分析期间区分库。
图书馆准备资源
NGS工作流程中的第二步:测序
在NGS工作流程的测序步骤中，库被加载到一个流单元并放置在测序器上。DNA片段簇在一个被称为簇生成的过程中被放大，产生数百万份单链DNA拷贝。在大多数Illumina测序仪器上，聚类是自动发生的。
在一个称为合成测序(SBS)的过程中，化学修饰的核苷酸通过自然互补结合到DNA模板链上。每个核苷酸包含一个荧光标记和一个可逆终止子，终止子可以阻止下一个碱基的结合。荧光信号表明加入了哪个核苷酸，终止子被切断，以便下一个碱基可以结合。
在读取正向DNA链后，读取的数据被冲走，反向DNA链重复这个过程。这种方法被称为成对端测序。
NGS工作流程中的第三步:数据分析
测序后，仪器软件识别核苷酸(称为碱基调用的过程)和这些碱基调用的预测精度。在数据分析期间，您可以导入您的测序数据到标准的分析工具或建立自己的管道。
今天，你可以使用直观的数据分析应用程序来分析NGS数据，而无需生物信息学培训或额外的实验室人员。这些工具提供序列比对、变体调用、数据可视化或解释。
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