在疟疾上建立全基因组网

介绍

人类疟疾寄生虫是地球上最具传染性的生物体之一。它们每年造成2亿多新病例和大约50万人死于疟疾，主要是撒哈拉以南非洲国家的5岁以下儿童。¹感染的最初症状包括发烧、身体疼痛和呕吐。随着病情的发展，患者可能会出现癫痫、呼吸窘迫和严重贫血。疟疾导致的死亡是由于血液流动和氧气交换阻塞到各个器官，包括大脑。

在过去的15年里，世界卫生组织、比尔和梅林达·盖茨基金会以及其他机构资助的疟疾控制、根除和疾病治疗工作，使每年的疟疾死亡率下降到以前的近一半。²很大程度上的成功是使用青蒿素药物有效治疗疟疾感染的结果。不幸的是，耐青蒿素菌株恶性疟原虫导致大多数致命疟疾病例的疟疾寄生虫，已经开始出现，这增加了最近抗击疟疾的成功可能很快就会付诸东流的可能性。

加州大学河滨分校(UC Riverside)的细胞生物学教授卡琳·勒·罗赫(Karine Le Roch)博士一直在研究细胞生物学恶性疟原虫了20年。她目前的研究重点是了解生物体的基因调控事件和机制，以识别新的药物靶点和开发有效的治疗方法。作为下一代测序(NGS)的早期采行者，Le Roch博士将系统生物学方法应用于她的研究，大量使用全基因组研究和其他基于测序的调查方法。

为了了解更多关于Illumina NGS系统是如何被用于推进加州大学河西分校的疟疾研究，我采访了Le Roch博士和她的两位研究同事，Le Roch实验室博士后Evelien Bunnik博士和Glenn Hicks博士，他是加州大学河滨分校整合基因组生物学研究所(IIGB)的植物细胞生物学家和研究设施主任。

从左到右:加州大学河滨分校细胞生物学教授Karine Le Roch博士;勒洛克实验室博士后伊夫林·邦尼克博士;以及IIGB研究设施主任格伦·希克斯博士。

问:生命周期是什么恶性疟原虫？

Karine Le Roch (KLR):的恶性疟原虫疟疾寄生虫的生命周期相当复杂，包括人类宿主和蚊子之间的几个连续阶段，人类宿主是无性寄生虫增殖的地方，蚊子是寄生虫有性繁殖的宿主，并作为疾病载体将寄生虫传递给其他人类。恶性疟原虫是一种单细胞真核生物，它改变自己的形状和结构以适应其生命周期的不同阶段，但没有人真正了解它如何调节基因表达。当你比较疟原虫其他真核生物的基因组，如酵母或人类，只有你所期望的三分之一的转录因子。

问:你的学习方法是什么恶性疟原虫？

KLR:我们使用全基因组系统生物学方法来研究寄生虫如何在转录或转录后水平上调节基因表达。我们在2D和3D水平上观察染色质结构，以及细胞核和细胞质内的一切，以了解基因调控、细胞分化和两种宿主的寄生虫发育。

问:您如何在研究中使用基因组学和NGS ?

KLR:我们可以用NGS设计很多类型的实验我们的想象力是唯一的限制我们可以用这项技术去理解什么恶性疟原虫基因调控。我们使用了我们能想到的所有全基因组类型的研究，包括ChIP-Seq, Hi-C, GRO-Seq, RNA-Seq, Poly-Seq和Ribo-Seq。*通过结合这些全基因组数据集，我们希望在计算水平上建立基因调控模型，并试图查明寄生虫特异性途径，以发现新的药物靶点。

“我们在之前的一些研究中使用了微阵列，但在噪声和背景方面存在问题。当我们开始使用NGS时，这些问题就完全消失了。”

问:与数组相比，NGS在你的研究中有什么优势?

KLR:有了NGS，我们可以做任何想做的研究。我们可以创造一种新的实验来观察每一对碱基对。我们在之前的一些研究中使用了微阵列，但在噪声和背景方面存在问题。当我们开始使用NGS时，这些问题就完全消失了。

Evelien Bunnik (EB):例如，我们使用NGS来观察恶性疟原虫细胞核内的基因组。对于这个应用，我们先进行限制性内切酶消化，然后进行连接反应，最后进行成对端测序。我们无法使用微阵列获得3D基因组结构信息。甲基化研究也是如此。

格伦·希克斯(GH):我们也不能用微阵列来观察新生的转录本。我们正在使用NGS进行核糖序列测序，将我们校园内的研究扩展到翻译水平。

KLR:我们依靠NGS进行染色质研究，使我们能够在3D水平上检查染色质结构和寄生虫发育过程中的基因调控之间的关系。

问:作为加州大学河滨分校的测序核心，IIGB何时开始为加州大学河滨分校的研究人员提供NGS服务?

“大酒店”:我们的IIGB协作资源组织实际上早于NGS。IIGB作为测序核心开始使用3730XL毛细管测序仪，这是对所有平板凝胶系统的显著改进。随着毛细管测序技术的成熟，我们转移到Illumina基因组分析仪，并在2008年增加了我们的第一台基因组分析仪II。我们很快就添加了HiSeq2000系统，升级为HiSeq 2500系统，然后收购MiSeq和NextSeq500系统。

问:从IIGB的角度来看，在你们的产品中添加Illumina NGS系统有什么好处?

“大酒店”:Illumina NGS使我们能够利用测序技术，以满足我们服务的所有群体的大部分集中资源需求。IIGB支持进行生物医学研究、病原体研究、植物生物学、生态学和其他研究的团体。我们在这里进行一些人类基因组研究，但与医学院不同的是，我们可能也在研究秀丽隐杆线虫、真菌、拟南芥或斑马鱼。作为该大学的核心测序站点，我们需要快速灵活的系统来解决尽可能多的研究需求。卡琳实验室和我们快速发展的校园中使用的研究方法的广度代表了NGS要求的不同范围。

“NextSeq 500系统性价比高，速度快，可以对疟原虫富含at的基因组进行测序。”

问:为什么要将NextSeq 500系统添加到IIGB服务中?

“大酒店”:HiSeq系统的8车道流单元非常适合某些类型的大型项目。然而，我们看到一个趋势，除了全基因组测序项目，研究小组正在进行更多的分析实验，如RNA-Seq。NextSeq 500系统可以有效地支持这一需求。

我们看到越来越多的人要求一次对1-3个样本进行测序。积累足够的样本来填充HiSeq流池可能需要很长时间，特别是对于我们不经常运行的流池类型。NextSeq 500系统之所以吸引人，是因为它让我们能够满足像Karine这样的研究人员的需求，他们需要等待太长时间才能在HiSeq系统上获得样本测序。通过消除填充HiSeq流池的要求，NextSeq 500系统使我们能够减少非常规样品测序的等待时间，从几周甚至几个月，在某些情况下，只需要一周甚至更少。小型项目可以在收到样本后几天内完成，这使得在拨款截止日期之前生成初步数据成为可能。这增加了UCR研究人员在获得资助方面的竞争力。

“我们一直在使用NextSeq 500系统来研究染色质结构变化和性别分化之间的关系。”

问:在IIGB加入NextSeq 500系统后，您和拉罗氏实验室对在你们的项目中采用新的测序系统有什么顾虑吗恶性疟原虫研究吗?

KLR:我们有点担心NextSeq 500系统，因为我们认为它可能不是高AT含量的基因组的最佳选择。这对我们来说是个问题，因为恶性疟原虫基因组大约80%是AT。我们在NextSeq 500系统上进行了一项试点研究，使用亚硫酸氢盐转换的库来生成围绕表观遗传模式的数据疟原虫与基因表达有关。它表现良好。

我们对NextSeq 500系统非常满意。它提高了我们的测序能力，与HiSeq 2500系统相比，数据质量没有显著差异。NextSeq 500系统性价比高，速度快，可以对疟原虫富含at的基因组进行测序。现在我们把上面的所有东西排序。

＂...NextSeq 500系统使我们能够将非常规样品测序的等待时间从几周甚至几个月，减少到一周甚至更少。”

问:NextSeq 500系统对IIGB服务提供有影响吗?

“大酒店”:我们于2015年9月收到NextSeq 500系统，并在一周内启动运行。在NextSeq 500系统上线后，它只是一个向研究人员宣传的问题，我们有一个新的，更快的音序器。在过去的3个月里，我们看到采用该系统的人数急剧增加，现在该系统一直在运行。更快的周转使研究人员能够快速审查数据，确定下一步要做什么实验，并返回更多的样本进行排序。许多研究人员正在迅速将他们的研究转移到NextSeq 500系统。它更大的每样产量和更高的多重水平使其成本有效。我们的系统得到了大学管理部门的支持，他们理解强大的中心基础设施的好处，以及如何将其转化为加州大学河滨分校的研究成功。

卡琳的实验室一直走在这所学校向NextSeq 500系统转型的前沿。他们不断地尝试新的方法和方法。对于这种实验性的方法，你需要有一个快速的转变;他们需要迅速得到结果，以决定如何为下次试验修改实验。我想说，NextSeq 500系统提高了我们科学家进行研究的能力，因为一切都在快速发展。从这个意义上说，它是我们所希望的一切，甚至更多。

问:NextSeq 500系统如何使你们目前的疟疾研究成为可能?

KLR:我们需要了解如何阻止寄生虫的发育和性别分化。性成熟的配子细胞是寄生虫向宿主传播所必需的。我们最近使用NextSeq 500系统来研究染色质结构变化与性别分化之间的关系。

我们已经鉴定了一些独特的和非典型染色质结构的单倍体基因组与性别分化。我们希望这将导致寄生虫特异性药物靶点的发现。如果我们能阻止性别分化，我们就能阻止疾病的传播。

参考文献

1. 世界卫生组织。情况介绍:2015年世界疟疾报告。www.who.int/malaria/media/world-malaria-report-2015/en/于2016年7月6日通过。
2. 世界卫生组织。全球卫生观察(GHO)数据:疟疾死亡人数。www.who.int/gho/malaria/epidemic/deaths/en/于2016年7月6日通过。

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