Edna Frontiers通过NGS揭示了地球的环境生物多样性
该小组对环境DNA进行排序，以检测哪些生物生活在一个生态系统中，协助生物多样性审计，识别入侵物种，为保护稀有和难以捉摸的生物做出贡献，等等。
Edna Frontiers通过NGS揭示了地球的环境生物多样性
介绍
巴蒂尔赫伯特,
eDNA前沿业务经理，
科廷大学
谢恩·赫伯特(Shane Herbert)是澳大利亚科廷大学(Curtin University)研究服务集团eDNA frontiers的业务经理。
当生物体在世界各地移动时，它们会脱落遗传物质。来自它们的皮毛、皮肤、鳞片和其他来源的细胞最终会进入环境，为那里存在什么生物提供遗传线索。很长一段时间以来，这种“环境DNA”或“eDNA”没有受到研究人员的重视。现在，科廷大学(Curtin University)的一个研究服务组织eDNA前沿(eDNA frontiers)已经找到了如何运用环境DNA来帮助企业、政府和研究人员研究生物多样性和生态系统的方法。
这个位于澳大利亚西部珀斯的小组正在分析eDNA，以揭示在不同的栖息地存在着什么生物。埃德娜前沿从环境中提取样本，然后使用Illumina的NGS技术对其中的DNA进行测序。测序数据可以识别出存在于eDNA样本中的生物，从而确定哪些生物曾在那个位置出现过。
eDNA前沿说，这项技术比科学家收集和鉴定生物体的传统方法更快，更全面。eDNA的应用也非常广泛，包括生物多样性审计、入侵物种监测、饮食分析、寻找稀有和难以捉摸的生物进行保护等等。“我们的客户来自世界各地，从事环境影响评估、生物多样性研究和许多其他应用，”eDNA前沿业务经理谢恩·赫伯特(Shane Herbert)说。“我们还会遇到很多新的应用。”
iccommunity与Shane Herbert讨论了eDNA前沿在环境DNA方面的工作，它目前在泰国和澳大利亚等国家的应用，eDNA未来可能如何使用，以及为什么Illumina的MiSeq和iSeq等NGS技术对eDNA测序至关重要。
问：什么是edna？如何使用它来衡量生物多样性并研究我们周围的生态系统？
肖恩·赫伯特:所有生物都会留下自己的沉积物——皮肤细胞、鳞片、毛发、粪便——这些都含有遗传物质。它们被遗弃的DNA所包含的区域不仅能告诉科学家关于生物体本身的信息，还能告诉科学家它们的分类信息。我们可以针对收集到的eDNA中的这些区域，对它们进行测序，然后在全球DNA数据库中找到分类匹配。
“通过这种方法而不是使用qPCR方法，你得到的信息不仅仅是一个物种，而是该分析所针对的所有物种。你最终会得到一个更广泛的生活在那个环境中的生物体名单，这给了你更多的解释能力。”
你会发现一些平时看不见的东西，比如幼虫阶段的有机体，或者在它们发育的各个阶段隐藏起来的难以捉摸的有机体。事实上，它们都在水或其他介质中留下了DNA痕迹，这使得它们可以被检测到。这是一种快速、经济地审计生物多样性的好方法。
生物多样性审计目前是eDNA的主要用途，但它的应用正在增长。你可以进入一个几乎不知道有什么的环境，然后用一般的或狭窄的分析来瞄准它。如果你更广泛地观察，你可以使用像18S这样的目标核基因来找到所有的真核生物，或者你可以使用更具体的FISH分析来缩小范围到物种水平。当生态系统发生破坏时，这些可以用来指导对环境影响报告的解释。或者你可以去捕猎入侵物种或稀有和难以捉摸的物种。这对饮食分析也很有用。
问:从事eDNA工作的最大挑战是什么?
承宪:我们处理的典型eDNA样本是过滤过的水，我们将水样本过滤到膜上，然后收集其中的生物材料。但重要的是要考虑如何抽样。
如果你在寻找海洋生物，你能在水里找到它吗?还是要刮一下才能发现?你会复制吗?如果有，在哪里复制?当然还有提取。
研究人员收集海水样本，然后将水样过滤到膜上，其中的生物材料在eDNA前沿被收集和处理。
你不能假设你的提取方法涵盖了一切。你需要确保你收集的细胞中的DNA可以用于分析。环境样本的另一个问题是，你通常处理的是降解的材料。细胞正在分解，所以你不太可能找到完整的基因组——它将是小片段。
另一个挑战是世界上到底有多少物种。有大量未知的生物。我们将所有样本与GenBank以及定制数据库进行比对，未知的数量仍然非常高。但在未来，当一个物种的DNA最终被测序并进入基因数据库时，我们仍然可以匹配我们的未知。这仍然是全球生物多样性的“待办事项”。
问：NGS在EDNA研究中玩什么作用？NGS提供的优势与QPCR方法或甚至PCR提供了什么优势？
“你可以确信一个阳性是真实的，因为目标序列在数据中，如果序列变异敲掉了qPCR检测，你会看到它和挽救假阴性。这是NGS的一个主要优势，我们可以看到我们测序的扩增子内部的变异。”
承宪:有了NGS，你可以得到很多信息。这是一个更广泛的结果，每个样本有更多的识别。它给了你更大的解释能力，看你的数据，并找出什么是那里，什么是缺失的，以及什么模式与其他采样区域的数据相关，如是否污染。你仍然可以用良好的敏感性来判断某一特定生物体的存在或缺失，比如入侵物种或有保护价值的动物。你得到了这个信息，还有其他的一切。额外的信息只是增加了样本来自哪里的环境图片，这很有趣。
在qPCR中，我们使用探针结合分析。输出是一个荧光信号，是或否。你所有的努力都要投入到这个实验中去，确保你的信号是你想要的。如果你碰巧放大了具有相同引物或探针序列的其他东西，那么你没有任何方法知道信号是否偏离目标。同样，如果qPCR是阴性的，那么你就认为它不存在。这就是序列信息非常有用的地方，因为它是自己的正控制。
这在生物监测研究中是很有趣的我们从一个大的地理区域中采集样本你可以看到整个区域的序列变化。它可以告诉你这些站点之间的连通性。这不是群体基因组学，但仍然是有用的信息。
问:你们用什么NGS方法分析环境DNA样本的生物多样性?什么是元编码方法?
承宪:我们不在环境样本中进行鸟枪测序的原因是它们充满了细菌和单细胞生物。如果你不看它们，它就会吞噬你的序列产量。你真正感兴趣的是隐藏在样本总数的1%或2%中。元编码允许您将所有其他内容筛选出来，并以更清晰的方式查看您感兴趣的内容。
此外，霰弹枪测序可以查看样本中所有生物体的基因组、线粒体和叶绿体DNA。那是很多的DNA。它大部分是未知的，因为它来自几乎不为人知或描述的物种。那些被分类识别的少数可能只有几个条形码区域被测序并加载到GenBank。所以即使有了所有的测序数据，你也不能用它来识别很多东西。元编码就像使用一个特殊的透镜，你只放大你在基因库中可以匹配的DNA，并故意排除所有无用的DNA。在元码目标中，整个基因组可以从32亿个碱基对(比如人类)减少到大约200到300个碱基对。
问:你们学院目前使用什么NGS系统?你使用这个系统的原因是什么?
Illumina下一代测序技术，如MiSeq和iSeq系统对测序eDNA至关重要，并与生物监测需求兼容。
承宪:我们是MiSeq的忠实粉丝。我们有一些这样的例子。我们使用它的主要原因是测序长度。多达600个循环，2x300，这涵盖了我们需要处理的所有条形码。他们比Illumina的其他系统要长一些，其他系统只能做2x150，这对我们的一些条形码来说不够长。
我们的MiSeqs 24小时运行，它们是非常好的小机器。我们还购买了一个iSeq，专门用于更多的移动条形码方法。我们把它放在一个有轮子的保护盒里，这样我们就可以到处移动它，给它充电，装载样品，现场排序。这是一个有趣的小实验，这个系统运行得很好。我们甚至把它放在一艘船上，合作团队出去在海洋中收集样本，并在海上进行测序。我认为iSeq非常好，它是一个非常强大的小系统。当然MiSeq是我们的主力。
问:eDNA测序的局限性是什么?
承宪:我们无法获得某一特定生物的个人信息，也无法确定哪一种动物去过哪里。序列变异是一个物种连接信息的有用工具，但它不是种群基因组信息。我们经常被问到eDNA是否能做这些事情，但目前它不能。也不可能总是达到物种层面，这偶尔是一个生物学问题——两个或更多的物种共享相同的序列，我们无法区分它们。还有一个“未知数”问题。在地球上所有的生物都有条形码序列之前，这总是一个DNA分析的局限性。
丰度是eDNA元编码面临的另一个问题。这与该方法的复杂PCR有关，它可能会在最终产品中引入偏差。但这也是一个生物学问题。例如，如果你在看池塘里的鱼，可能有一条大鱼和50条小鱼。更小、更年轻的鱼不太会脱落。较大、年龄较大的鱼会脱落大量细胞，并以较高的速率释放eDNA。因此，虽然我们可以对序列读取进行排序和计数，但生物学会影响结果，它不一定会是准确的。我们可以估计相对丰度，但这不是我们倾向于依赖的东西。具有讽刺意味的是，qPCR在这方面更有帮助。但即便如此，它仍然需要对每种类型的生物体进行评估。
问:eDNA前沿目前正在进行哪些项目?
承宪:在东南亚地区有几个很好的例子。海运和入侵物种是一个很大的问题——许多人都在考虑入侵海洋物种转移或转移的机会。人们对入侵物种的兴趣已经存在很长时间了，所以它们已经被分类识别和排序了。所以，这是一个很好的环境用于eDNA研究。
eDNA是对生物进行生物多样性审计的一种很好的方法，而不需要捕捉和杀死它们，比如杂草海龙，这是澳大利亚温带海洋水域特有的物种。
在从其他地方远航的船只停靠的港口，用漂浮的阵列采集eDNA样本，这些阵列上有沉降板，可以让藻类、螃蟹和其他什么东西在上面生存。也许两个月或六个月后，它们被收集起来，生物污染物被刮掉，然后我们对它们进行测试。我们首先在分诊系统中使用通用分析，以确定是否存在入侵物种。如果有的话，我们会做另一系列的测试来确认是否有特定的入侵物种存在。最终，一项正在进行的eDNA生物监测研究帮助支持了港口的资源管理计划，允许他们在需要的时候部署补救行动，而不是总是泛泛地应用它们。
eDNA的另一个应用是在泰国海的石油和天然气钻井平台上。这是一个大项目科廷大学的教授之一，尤安·哈维，正在与雪佛龙公司合作研究他们在泰国海的海上平台，这些平台已经存在了三四十年。它们的生命即将结束，需要退役。这项研究包括在它们被取下之前在深水中提取它们的eDNA样本。它们身上生长着三、四十年的生物多样性。它们是非常活跃的地方，有很多人生活在那里。
这是一个生物多样性审计，看看有什么，但这也是一个入侵物种检查。一些退役平台的目的地可能更靠近海岸，用于娱乐和渔业。尤安做了一些研究，表明这些3D结构实际上比珊瑚礁更能促进鱼类生长。但在你把它移去帮助渔业之前，你要确保它有一组安全的生物，你没有把入侵物种转移到当地的珊瑚礁上。使用eDNA有助于做出这些决定，它比视觉识别所有这些更简单和更快。
“eDNA是一种很好的靶向这些生物体的方法，而不需要捕捉和杀死它们。它让你有机会通过它们留下的东西而不是生物体本身来发现它们。”
此外，在对这些深水外套取样时，你可以得到在其他研究中没有得到很好代表的稀有和难以捉摸的生物体的DNA。
这些生物的粪便也很有趣，因为你可以做一个eDNA研究，得到它们的饮食概况，这可以告诉你它们生活的环境。这直接影响到物种的保护管理。
问:您对有兴趣使用eDNA技术的研究人员和公司有什么建议?
承宪:我的第一个建议是知道你在寻找什么。我们可以取一个样本，排序，然后告诉你那里有什么，但如果你细化这个问题会更好。你对鱼感兴趣吗?甲壳类动物吗?我们进行了130次测试，针对不同的东西，其中20次针对鱼。
适当设定预期也是值得的，因为edna并不能解决所有问题。在解释方面仍有工作要做。我们通常不解释eDNA前沿的结果。我们会根据结果告诉你什么是存在的，但值得注意的是，很难确认什么是不存在的，因为它可能是一种基因变异，被化验漏掉了。
问:你能测量到多少年前的eDNA?
承宪:降解率变化很大。它与温度，pH值，细菌，抑制剂，所有这些东西有关。这不是一个容易回答的问题。eDNA确实存在，但它不会永远存在。一般来说，eDNA在体内停留的时间不会超过几小时到几天。话虽如此，我们已经做了古代DNA的研究，这可以追溯到很长的一段时间。我们的姐妹学术小组，科廷大学的痕量和环境DNA(或趋势)实验室正在参与一项对加拿大一个湖泊的研究，该湖泊可以追溯到20万年前。合作小组取了一个代表这个时间尺度的冰芯样本，他们可以确定很久以前的植物种类。所以时间尺度是很复杂的。
然而，在泰国有一个关于深水油气套管的很好的研究，我们在水面取水，10米，20米，30米和沉淀物。生物多样性的分布很好地聚集在一起——我们在每个点采集的水样的不同环境与深度有关。你可能会认为这是水，它到处移动，但事实并非如此，所以它的降解速度足够快，这样的应用才有意义。
问:你对eDNA在未来的研究和使用有何设想?
承宪:这个领域有很多地方可以做，比如开发一个更快的流程来帮助在分析时做出决定。例如，你可以在水道一侧采集样本，并得到一个快速的结果，实时地为地面上的管理策略提供信息。富足是我们想要解决的另一个问题。它将使eDNA分析非常有帮助，以知道有多少特定的物种在特定的时间存在。想想看，如果你能监控鱼类在繁殖过程中沿着海岸线或水路的迁徙，这将是在这一脆弱时期更好地保护它们的一个好方法。
我的印象是，监管当局开始认识到这种技术的好处，并制定指南和建议将其用于特定的生物和应用群体。这些将是eDNA的帧转移时刻，它的使用将会增加。然而，与此同时，仍有许多方面需要解决，以便eDNA可以可靠地使用。我们参与了澳大利亚的一些倡议，并密切关注全球事件，所有这些都令人鼓舞。我怀疑在未来一两年，这将成为环境监测的正式组成部分。
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本文是与以下公司合作撰写的:
