利用基因发现和细胞模型来理解神经发育障碍的遗传学基础
介绍
生活在澳大利亚的拉克兰·乔利博士充分利用了户外提供的一切。当Jolly博士不再骑车、冲浪、徒步旅行或打篮球时,他参与了同样广泛的研究项目,以识别和研究导致神经紊乱的基因。为了发现新的基因变异并描述它们在智力残疾中的作用,Jolly博士将基于细胞的模型与多种基因和功能基因组技术相结合。
作为阿得雷德大学的澳大利亚研究委员会研究员,乔利博士在神经遗传学研究项目中起着主导作用。当其他研究小组发现神经发育障碍背后的基因变异时,Jolly博士指导研究以发现基因变化的影响。Jolly博士说:“我们想知道基因变异在大脑发育中有什么功能作用。”。“我们知道它们会导致人类疾病,但我们想知道它们是如何影响细胞的行为和交流方式的。”该研究小组利用下一代测序(NGS)来识别新的突变,并利用胚胎神经发育的细胞培养模型来深入了解对大脑发育和功能重要的新基因网络。他最近的一些研究发现,有两种基因(UPF3B和HCFC1)X染色体上的基因在智力残疾中起作用。在百忙之中的休息时间,Jolly博士与iCommunity谈论了他的基因发现研究。
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问:是什么激发了你的研究,导致你确定了UPF3B和HCFC1基因变异?
拉克兰·乔利(LJ):2009年,我们参与了一项已发表的研究,该研究涉及200多个智力残疾家庭,受影响的男性成员占多数,这表明X染色体可能与此有关。我们对该队列的X染色体上的整个编码区进行外显子组测序,以发现致病基因变体。这项大型基因组研究涉及到我现在正在研究的许多基因,包括UPF3B和HCFC1.
我们在队列中找到了几个家庭,它具有完全丧失的功能突变UPF3B.根据遗传学,我们马上就知道了UPF3B批判性地参与了大脑发展。我们直接侵蚀了该基因的突变如何导致受影响的个体中看到的异常脑发展。1.,2.
这个HCFC1这项研究是在我们认识到队列中有一个多代的大家庭,其中有许多受影响的男性时开始的。我们确定X染色体参与,但我们无法在编码区找到任何可以解释表型的致病性变体。通过额外的基因组学分析进行更广泛的研究表明,非编码变异体参与了HCFC1基因。3.
问:通过使用不同类型的细胞系,yobet亚洲我们可以了解到关于大脑发育的什么信息?
LJ:我们经常启动新基因和基因变异的功能性询问体外细胞系,因为它们允许我们快速筛选变异,并决定是否需要更复杂的模型。与体外在细胞系中,我们可以很容易地获取材料,并对其进行基因操作,以适应我们的模型,并获得快速读数。
我们发现离体从发育中的大脑或胚胎干细胞中获得的有可能分化为脑细胞的培养物可以作为大脑发育的替代物。与静态细胞模型不同的是,静态细胞模型没有或有限的分化潜能,或者对大脑发育的各个方面进行建模,我们选择了细胞培养模型来重现大脑发育的事件。这给了我们所看到的东西之间的关联体外在开发期间患者的大脑可能发生了什么。通过这些信息,我们可以继续前进到更复杂的动物模型,我们可以研究行为和生理系统,脑网络。
“我们正在发现以前从未与遗传疾病,特别是神经发育性大脑疾病相关的基因。”
问:这是什么途径UPF3B影响?
LJ:UPF3B已知参与废话介导的mRNA衰减(NMD)途径。最初发现NMD作为mRNA监测机制,其中它识别并降解了早期终止密码子的转录物。因此,它涉及所有遗传疾病的近三分之一,由过早终止密码子引起的相同数量的遗传疾病。然而,NMD途径现在也被认为是主要的基因调节途径,许多内源mRNA转录物遍及通过NMD调节的特征。敲出核心NMD组件,UPF1或UPF2,导致正常转录组的5-10%去调控。这些转录对发育很重要,因为在小鼠、斑马鱼和苍蝇模型中观察到胚胎致死表型。相比之下UPF3B人类的突变不是致命的,而是导致智力残疾。鉴于其在NMD中的作用,我们假设NMD途径可能在受影响个体中受损,并且其转录组可能发生改变。
问:什么是有什么影响UPF3B突变对大脑发育和智力残疾的影响?
LJ:智力残疾由此产生UPF3B突变范围从轻度到严重,并且可以包括诸如自闭症,注意力缺陷多动障碍(ADHD)和精神分裂症等额外行为问题。我们已经确定了我们研究过的受影响人物的表型谱。即使在一个具有相同的两个兄弟的单个家庭内,也存在表型变异性UPF3B突变,一个兄弟有严重的智力障碍,而另一个只有轻微的影响。
我们发现了一种机制,它可能会改变UPF3B突变导致疾病结局。这个UPF3B基因有一个副病虫病,UPF3A.缺少UPF3B作用UPF3A可以部分冗余地工作,介入并取代UPF3B.我们发现在温和地受影响的兄弟中,UPF3A与他严重受累的兄弟姐妹相比,这种表达升高,这是我们在其他患有癌症的人身上看到的趋势UPF3B突变。我们现在正在系统地测试UPF3A功能可能是疾病结果的一个调整因素。通过我们的研究,我们得出的证据表明UPF3B以某种方式改变转录组,导致发育中大脑原始细胞行为的改变。我们现在正在测试UPF3A功能可以挽救这些缺陷。
“Illumina技术对于我们理解未诊断的神经发育障碍背后的遗传学至关重要。”
问:是什么促使您在非编码区域中查找HCFC1?
LJ:我们评估了来自一个多代大家庭的样本,其中有许多受影响的男性个体,筛查X染色体上的每个编码区域,以发现变异。然而,我们没有发现任何编码变体。
然后,我们进行了连锁分析,以确定在受影响的个体中共享的染色体部分,而在未受影响的雄性中不共享的染色体部分。这使我们能够专注于X染色体的一个小区域,它只包含108个基因。我们用Illumina Genome Analyzer系统对这些基因周围的所有编码和调控序列进行了测序,获得了极高的覆盖率,平均每个碱基对读取100多个序列。当我们再次发现该区域没有变异时,我们将目光投向编码区域之外。我们发现了一个有趣的非编码变体,它影响了基因间区域高度保守的转录因子结合位点。这种非编码突变导致一种叫做YY1的转录因子的结合缺失,这种转录因子通常会抑制基因的表达HCFC1表达。
问:你是如何发现HCFC1在正常的大脑发育中?
LJ:像HCFC1它本身就是一个转录协同调节因子,我们希望在患者身上发现转录组学变化,这可能进一步暗示它的参与。我们使用患者来源的血细胞系,称为淋巴母细胞系,进行研究HCFC1.虽然这些细胞系来自血液,但它们的转录特征与神经元和大脑支持细胞重叠,使它们能够作为大脑内部可能发生的事情的代理。利用淋巴母细胞系,我们发现HCFC1过度表达,这与约200个其他基因的去调控有关。通过基因本体分析运行基因进一步支持了HCFC1,识别过程HCFC1已经知道控制,如线粒体和染色质的调节。更重要的是,将基因本体分析联系起来HCFC1随着神经元的发育和分化。从那里,我们决定模拟HCFC1研究过度表达在大脑发育中的作用。
问:你是如何做模特的HCFC1?
LJ:基因本体途径表明HCFC1与前脑发育有关。我们从胚胎小鼠前脑中分离并培养了神经元和神经干细胞体外. 这给了我们一个机会来操纵它们,并尝试创建一个疾病模型。我们过度表达HCFC1,并监测这如何影响神经细胞的行为。HCFC1对正常细胞行为有强烈的影响。神经元的轴突和树突生长减少,而神经干细胞的过度表达诱导它们退出细胞周期并分化为星形胶质细胞。这为基因上游的非编码突变提供了支持性证据HCFC1导致其过度表达可能会对人类大脑发展的影响可能产生影响体内.
“我们的功能研究有助于指出大脑发育的哪些细胞类型或方面受到影响,并可能导致发现新的治疗靶点和方案。”
问:过度表达如何HCFC1导致智力残疾?
LJ:这在目前很难回答。我们没有足够的信息把我们看到的联系起来体外我们可以从大脑结构中得到什么。这些患者还没有进行详细的MRI分析来观察他们的大脑结构。我可以假设,当神经干细胞的生长方式发生改变时,如果退出细胞周期,表型相关的是小头症,如果神经干细胞具有额外的增殖能力,表型相关的是大头症。这可能是因为我们没有意识到大脑中有畸形的部分,这与我们所看到的是一致的体外. 其他影响更为微妙的因素也可能起作用,如神经元细胞连接或通讯缺陷。需要更复杂的模型,如转基因小鼠,以更好地理解基因的作用HCFC1在脑部疾病。
问:你如何决定在你的研究中使用哪些技术?
LJ:如果我们发现了一个我们认为与之相关的基因,我们就会受到该基因已知信息的引导。UPF3B和HCFC1都是调节基因表达的基因。UPF3B是mRNA衰变机制的一部分吗HCFC1是一种转录辅助调节因子。知道转录组可能受到影响,我们使用RNA-Seq分析这些特定的突变对患者来源的细胞系的转录组有多大的影响。如果这些信息暗示了大脑发育的任何方面,我们可以用体外神经细胞模型系统。在这两个基因的例子中,这种方法非常成功。
问:Illumina测序系统和阵列如何帮助您进行研究?
LJ:我们在HiSeq 2500系统上进行外显子组测序以发现基因。我们使用HiSeq X Ten系统进行全基因组测序,我们使用Illumina阵列进行连锁和位点定位。Illumina技术对于我们理解未诊断的神经发育障碍背后的遗传学是绝对关键的。它们使我们能够发现新的基因,然后我们可以通过在基于细胞的模型中进行功能研究来进一步分析这些基因。
为了HCFC1项目,我们在Hiseq 2500系统上进行了RNA-SEQ的转录组分析,以及Humsht-12 V4表达珠芯片。我们选择了这个阵列,因为它与QPCR和RNA-SEQ数据提供了良好的一致性。
为了UPF3B在该项目中,我们使用RNA-Seq和HumanOmni BeadChips分析患者细胞系中的拷贝数变异。研究拷贝数变异很重要,因为每个个体都有自己的基因组变化。基因表达的变化是否与拷贝数的增加或减少相关是我们感兴趣的研究课题。具体地说,我们想了解在患有癌症的个体中转录组是否发生了变化UPF3B突变是由于NMD缺陷,或由于个人拷贝数的变异。
“会有很多变体以问号结尾。在更基于研究的环境中使用NGS将需要帮助分配功能的过程。”
问:你的发现如何UPF3B和HCFC1改善人类健康?
LJ:我们正在发现一些基因,这些基因以前从未与遗传疾病,尤其是大脑神经发育障碍有关。当我们公布我们在各种公共数据库中发现的表型和基因型时,这有助于我们对智力残疾的潜在原因的集体理解,这影响着研究工作和临床诊断。我们希望,通过进一步强调这些病例,将为受这些基因变化影响的其他人提供诊断测试和解决方案。
就促进新疗法的发展而言,我们还有很长的路要走。我们的功能研究有助于指出哪些细胞类型或大脑发育方面受到了影响,并可能导致新的治疗靶点和机制的发现。例如,我们有持续的审讯UPF3A以及它在改变结果中的潜在作用UPF3B突变。然而,对治疗策略的发展和科学检测是一个经常需要多年或数十年的过程。我们只是在研究这些新发现的基因的过程开始。
问:你认为NGS对你未来的研究有什么影响?
LJ:NGS已从一种主要基于研究的工具发展成为临床诊断中的一种流行方法。因此,许多新的基因变异正在被识别出来,但随之而来的挑战是如何将功能分配给未知意义的变异。我们可以将大型数据集亚博下载app和队列一起进行比较,这在分配显著性方面提供了一些实用性,例如它可能有多罕见,或者以前是否在具有相似表型的患者中发现过。然而,将有许多变体在其旁边带有问号。正如我们在研究中所做的那样,在更多基于研究的环境中使用NGS将有助于分配功能。例如,在我们的研究中询问转录组UPF3B和HCFC1患者细胞系,NGS非常适合,提供了他们的参与的证据,并引导我们的基于神经细胞的研究来帮助识别发育,细胞和分子机制。NGS技术无疑将发挥重要作用,支持有争议的高吞吐量,和/或对样品的高度深度分析,以应对临床诊断和更多的研究为以重点的问题。
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HumanHT-12 v4表达芯片,www.169o.com/technologies/microarray/human-geneticing.html
工具书类
1. | Nguyen LS、Jolly L、Shoubridge C、,等.转录组谱分析UPF3B/来自各种形式智力残疾患者的nmd缺陷淋巴母细胞。分子精神病学.2012; 17:1103 - 1115。 |
2。 | Jolly LA,Homan CC,Jacob R,等.这个UPF3B该基因与智力残疾、自闭症、ADHD和儿童期精神分裂症有关,调节神经祖细胞行为和神经元生长。嗯,吉奈摩尔.2013; 22:4673 - 4687。 |
3. | 黄丽,乔丽,威利斯,欧文,等.(2012).非编码,监管突变含义HCFC1非综合征性智力残疾。是嗯。基因.2012; 91:694 - 702。 |