展望精准肿瘤研究的单一药物方法

简介

在位于南达科他州苏福尔斯的区域卫生系统Avera Health的精准肿瘤中心，Brian Leyland-Jones医学博士和他的团队进行了临床研究，以识别、分析和验证具有诊断疾病潜力的生物标志物，并为癌症治疗决策提供信息。与Leyland-Jones博士密切合作的是Brandon Young，他是加州拉霍亚市鲍登精准肿瘤临床实验室分子和实验医学测序主任。他们一起进行DNA和RNA下一代测序(NGS)研究，以及蛋白质组学肿瘤分析，以设计实验性药物组合。

他们的方法中的转录组元素是至关重要的。他们不希望局限于将单个DNA突变与相应药物相匹配的“传统”单一药物方法。“就像三联药物组合对艾滋病和结核病有效一样，我们认为三联或更多的药物组合可能对癌症治疗有效，”杨说。“RNA测序(RNA- seq)使我们能够确定是否涉及特定的生物途径，”莱兰-琼斯博士补充道。“通过从基本DNA转移到激活通路的转录组特征，我们可以更接近癌症蛋白质水平的实际情况。”

iccommunity采访了Leyland-Jones博士和Young先生，讨论了他们的研究目标，正在进行的RNA-Seq研究，以及他们对NGS在癌症医学中的未来展望。

Brian Leyland-Jones，医学博士，是Avera癌症研究所精确肿瘤中心的肿瘤学家/血液学家，Brandon Young是鲍登精确肿瘤临床实验室分子和实验药物测序主任。

问:你研究的主要重点是什么?

布莱恩·莱兰-琼斯(BLJ):肿瘤是克隆性的，每个肿瘤驱动细胞群之间都存在克隆依赖性。我们正在寻找三到四种药物的组合，以关闭所有的克隆驱动因素。这是一种非常激进的方法。除了拉泽尔·库兹罗克博士，他开发了美国最大的一期临床试验之一，¹大多数学术中心使用测序来将受试者与单药治疗研究相匹配。

问:你为什么加入艾维拉健康?

BLJ:2013年底，我的11人团队找到Avera Health，看它是否愿意接受我们的测序专业知识。我们正在寻找一个先进的肿瘤学环境，并支持癌症主题测序数据库的开发。我们现在已经对大约700个个体进行了测序。

问:为什么你们的测序实验室在圣地亚哥，而不是Avera Health总部所在的南达科他州?

BLJ:我和布兰登·杨有近十年的合作关系。在南达科他州的挑战之一是在这个领域招募高度专业化的基因组和临床试验人员是多么困难。然而，如果你在拉霍亚的台地上工作，你就坐在Illumina，数百家其他生物技术公司，以及加州大学圣地亚哥分校，斯克里普斯研究所，索尔克研究所和桑福德·伯纳姆·普雷比斯医学发现研究所的旁边。我们在拉霍亚的位置使我们能够与圣地亚哥地区的其他生物技术公司合作。全球创新网络(WIN)联盟也将我们的拉霍亚实验室作为其精准肿瘤学实验室的全球中心。

“我们使用NanoString nCounter直接杂交技术，将RNA- seq与NextSeq 500系统上的TruSeq RNA Access进行了比较。”

问:肿瘤RNA测序的价值是什么?

布兰登·杨(BY):传统上，DNA测序更容易执行。传统的项目如NCI-Match*和Stand Up To Cancer旨在将单个DNA突变与单一药物治疗联系起来。我们的多药治疗方法需要更多的信息。我们需要来自多种方法的信息来确定哪些药物可以有效地联合使用。

癌症有几个主要的网络和途径。就像我们看到三联药物联合治疗艾滋病和结核病一样，我们认为三联药物联合治疗癌症也很有效。RNA-Seq表达分析使我们能够确定一个特定的生物途径，如参与血管生成的途径，是否上调，并在组合方法中代表一个可能的靶点。

发现DNA突变还不够，因为它可能不会一直被表达。因此，RNA-Seq可能会告诉我们基于DNA分析的方法是否有效。有针对融合的定向治疗，所以我们想知道融合本身是否真的表达出来了。RNA-Seq是一个很有价值的工具，可以让我们全面了解肿瘤生物学。同样，我们认为蛋白质组学和蛋白质磷酸化将是重要的。

我们仍然认为DNA测序是绝对基础的，需要进行测序来确定疾病状态，尤其是癌症。RNA-Seq是一种重要的补充，它提供的信息不仅仅是简单地观察突变并试图将其与药物匹配。

BLJ:如果你在看HER2拷贝数,HER2荧光原位杂交(FISH)比率，或定量免疫组化(IHC)，所有这些都与赫赛汀相关并受益于赫赛汀。然而，目前最好的标记是在成绩单水平。在磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路改变的肿瘤病例中，我们的工作已经表明，与活性的最佳相关性是在磷酸化蛋白质组学水平，而不是DNA水平。所以，我们认为进一步深入转录本或蛋白质水平会更好。我们与哥伦比亚大学的Andrea Califano合作，他开发了激活通路的转录组特征。通过从DNA上升到转录特征，我们可以更接近癌症中蛋白质水平的实际情况。

问:为什么你们使用测序而不是杂交方法?

由:十年前，布莱恩和我开始使用Illumina微阵列技术对10年的临床试验样本进行回顾性分析。我们的想法是回顾并比较反应者和非反应者。NGS问世后，我们开始使用HiSeq™2500系统。我们也是最早使用TruSeq™RNA Access Library Prep Kit的团队之一^__在研究中。

我们用微阵列分析了8000到10000个样本，用RNA-Seq分析了几百个样本。其中一个重要的问题总是成本。如果你运行400-500个样本，测序整个转录组的成本就会增加。Illumina了解整合DNA和RNA序列信息的互补方法的价值。TruSeq RNA Access的开发使这些研究能够更经济地进行。

“如果你想让自己有机会超越我们目前所说的‘临床相关’，获得更多的数据用于合作，并在以后进行回顾，RNA-Seq是正确的选择。”

问:您是否比较了RNA-Seq与基于杂交的方法的优点?

由:我们希望我们的方法是不可知的，所以我们进行了平台比较研究，以揭示我们在使用不同平台的数据类型、数据质量和成本方面的知识差距。我们使用NanoString nCounter直接杂交技术，将RNA- seq与NextSeq™500系统上的TruSeq RNA Access进行了比较。我们知道每个样本的NanoString nCounter成本是执行RNA-Seq成本的一半。我们想确定如果在两个平台上运行相同的样本，是否可以获得相同的表达式配置文件。

我们发现相关性非常高，在0.98-0.99范围内。因此，如果我们只比较770个基因纳米串nCounter癌症通路面板上的基因与TruSeq RNA Access转录组测序试验中的相同基因，纳米串的成本将更低，我们为这770个基因确定的表达谱将是相同的。

然而，成本与覆盖率是另一回事。当我们结合泛癌症免疫分析小组和泛癌症途径小组时，我们获得了总共约1200个基因的转录数据。这些联合PanCancer面板的成本与运行TruSeq RNA Access的成本相同。然而，TruSeq RNA通路涵盖了这1200个基因和另外2万个参与这些途径的基因。它还提供了查看融合调用的能力。

我们从TruSeq RNA Access获得的丰富数据，以相同的资金和相同数量的RNA起始材料，向我们表明，选择Illumina平台可以获得更多的机会。如果你想让自己有机会超越我们目前所说的“临床相关”，获得更多的数据用于合作，并在以后进行回顾，RNA-Seq是正确的选择。

问:你为什么选择NextSeq 500系统?

由:当我们四年前建立拉霍亚测序实验室时，我们最初的计划是使用HiSeq 2500系统。在此期间，Illumina公司推出了NextSeq 500系统。布莱恩和我审查了它的规格和功能，并得出结论，NextSeq 500系统将成为分子病理学实验室的测序主力。这就是我们选择它作为实验室的原因。

问:NextSeq 500系统有哪些好处?

由:根据我们之前在核心设施方面的经验，我们一直在努力经济地使用HiSeq 2500系统的全部容量。一周可能得到4 5或10个样本，下一周得到3个样本。你需要8个样本来填充HiSeq上的车道，但当你需要提供快速周转时，你不能坐着等待样本积累，这样你就可以批量处理它们。我们意识到我们可以用一个HiSeq系统的价格拥有两个独立的NextSeq系统。一个NextSeq系统可以运行DNA，一个可以运行RNA，或者我们可以同时运行RNA和DNA，我们不需要等到我们有大量的样本。

因此，我们选择NextSeq 500系统的主要原因是，我们的RNA和DNA测序仪器的吞吐量可以灵活地与样品的进入方式相匹配，并且我们有能力提供快速周转。此外，由于我们专注于捕获技术和全转录组分析，我们对全基因组测序没有重大需求。HiSeq 2500系统，甚至NovaSeq 6000系统的高吞吐量和高成本效益确实可以让一些团队受益。然而，像我们这样的实验室将从NextSeq 500系统中获得更大的好处，该系统提供了快速的周转和一次运行更少样品的经济能力。

“我们从TruSeq RNA Access获得的丰富数据，以同样的资金和同样数量的RNA起始材料，向我们表明，选择Illumina平台可以获得更多的机会。”

问:如何处理福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)保存的样品?

由:当我们最初开始这项研究时，我会开玩笑地说，我对为我们提供样本的病理部门又爱又恨。他们一直用FFPE保存样品。我有研究背景，想要新鲜冷冻的原始样本。在过去的五年里，我们已经发展了我们的思维，并理解了拥有FFPE样本的价值。

FFPE保存使我们能够解决肿瘤异质性问题。病理学家可以检查FFPE载片并确定肿瘤含量最高的区域。我们可以切下特定的部分进行分析，我们也可以从载玻片上取邻近的正常组织作为比较物。

问:FFPE样品的质量提高了吗?

由:FFPE样品对我们来说更可行的一个原因是我们现在处理的FFPE样品的质量。与人们从20世纪60年代和70年代提取几十年前的样本所面临的挑战不同，我们通常在进行活检后的一个月内提取RNA和DNA。此外，我们现在使用的脱乙酰化方案更温和，并保留更多完整的RNA。我已经很长时间没有见过降解到片段少于100个碱基对的样品了，我们无法分析它。

使用TruSeq RNA Access，甚至是全转录组试剂盒，第一步通常是将RNA片段化。FFPE保存的RNA片段，节省了我们在分析的一步。我们经常发现我们提取的RNA保存得足够好，所以我们仍然需要进行分解步骤。FFPE协议和Illumina库准备试剂盒已经以这样的方式发展，FFPE组织不再是一个很大的挑战。

问:你有没有研究过区分肿瘤异质性的其他方法?

由:我们已经涉足激光捕捉显微解剖。有了激光捕捉技术，一名优秀的技术人员每天可以对一些样品进行显微解剖。细胞粘附在捕获膜上的方式使得提取更加困难。进行标准的显微解剖没有那么有选择性。然而，一个好的病理学家可以在5-10分钟内在血氧霉菌素和伊红(H & E)染色玻片上圈出肿瘤切片。用解剖刀或刀片手工进行显微解剖还需要一分钟。在手术切除的情况下，我们不是切除我们想要的部分，而是切除我们不想要的部分，以从标本的多个部分获得肿瘤内容。

这就变成了你排序深度的问题。这是我们与信息学团队密切合作的事情。我们希望根据分析参数以及有多少reads映射到TruSeq RNA Access转录组序列来确保我们有尽可能多的reads。所有这些因素都使我们对实验本身有信心，并能够解决这种异质性。从技术角度来看，TruSeq RNA Access在最大限度地提高我们专注于已知转录组的能力方面做得很好，这样我们就可以从成本和数据的角度获得最大的收益。

＂...我们选择NextSeq 500系统的主要原因是，我们的RNA和DNA测序仪器的吞吐量可以灵活地与样品的进入方式相匹配，而且我们有能力提供快速周转。”

问:您是否考虑过通过单细胞测序来确定肿瘤的异质性?

由:我相信单细胞测序有独特的价值，但我们还没有达到可以以经济有效的方式进行测序的地步。其中一个问题是，我们正在对10万到50万个细胞进行rna测序，大致相当于你从病理幻灯片上取的dna。目前还没有有效的方法从FFPE样本中制备这么多的单个细胞。我看过单细胞数据，就处理异质性的方式而言，它看起来很棒。然而，从肿瘤分析的角度来看，我们必须分离和测序的细胞的绝对数量将是一个挑战。Brian和我随时了解新技术的开发、发布和改进。我们会让这个领域成熟起来，同时专注于我们的转化研究。

BLJ:目前，我们正在对组织和血液进行DNA靶向测序。我们使用这种组合来补偿某种程度的异质性。有几个小组正在进行联合循环肿瘤细胞(CTC)和无细胞DNA (cfDNA)分析。我们需要回答这些问题:ctc适用于哪里?转录组学和蛋白质组学适用于哪里?我认为这些问题比在单细胞测序水平上分析更重要。

问:未来测序在癌症医学中的作用是什么?

由:我们认为DNA测序将在十年，甚至五年内成为标准做法。我们认为RNA也是一样的。

BLJ:在五年内，测序将与常规放射学和病理学一起用于癌症分析。这项技术很快就会被应用到临床中。在最近的一次患者维权会议上，库兹罗克博士说，五年后，如果医生不对癌症患者的组织样本进行测序，将被视为渎职。

我相信这些化验结果会被送到每家医院的分子病理学实验室。正如我们现在在临床实验室拥有生物化学和血液学检测系统一样，我认为每个医院的分子病理学实验室都会有测序平台。TruSeq RNA Access的引入正在为这一转变做准备。

随着我们多年的进步，人们将从DNA序列分析转向转录组学和蛋白质组学。某种DNA水平的定向测序面板将一直被使用。然而，评估融合、microRNA和表达水平将变得更加重要。

我们认为Illumina平台代表了未来五年肿瘤学的发展方向。

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