研究人员在HIV-1趋向性研究中从旧技术转向新技术
MiSeq系统的特点，包括易用性、测序深度和高灵敏度，使研究人员能够匹配或超过使用罗氏454系统获得的结果。
研究人员在HIV-1趋向性研究中从旧技术转向新技术
介绍
Jacques Izopet博士和Stéphanie Raymond博士在法国图卢兹的Université Paul Sabatier研究HIV的嗜性(边栏)以及它在感染进程中如何变化。在过去的10年里，他们使用了各种表型和基因型方法来评估HIV是如何通过共受体进入细胞的。2010年，他们在罗氏454系统上开发了下一代测序(NGS)方法，用于评估HIV 1型(HIV-1)辅受体的使用。随后，罗氏宣布454系统停产，试剂将很快停产。
该团队致力于确定一个新的NGS平台。他们选择了MiSeq系统，并开始了比较研究，专注于深度测序敏感性、共受体评估数据和总体性能。1
我的社区采访了博士。Izopet和Raymond来了解他们如何评yobet亚洲估MiSeq系统上的HIV-1倾向检测方法以及他们获得的结果。
Jacques Izopet博士是病毒学实验室的主任，Stéphanie Raymond博士是病毒学系的研究员Université Paul Sabatier在法国图卢兹。
问:如何确定对HIV-1的趋向性?
斯蒂芬妮·雷蒙德(SR):HIV-1共受体使用的主要基因型决定因素是基于gp120包膜糖蛋白的第三个变量环(V3)的测序。我们开发了从V3氨基酸序列预测HIV-1辅助受体使用的算法。
雅克Izopet (JI):我们还开发了一种表型方法，图卢兹取向试验（TTT），用于确定病毒进入细胞的机制使用从血浆样本中分离的RNA扩增编码gp120 env基因的片段。该产物用于产生表达受挑战的env基因的重组病毒颗粒。然后将这些颗粒释放到上清液中，感染携带CD4并表达CCR5或CXCR4的U87指示细胞（侧栏）。
hiv - 1主机取向
向宿主性是指病毒通过结合特定的共受体而感染特定宿主细胞的能力。HIV-1通过一个或两个宿主细胞趋化因子共受体CCR5和CXCR4进入表达cd4的细胞。使用这些共受体之一的病毒株分别被称为R5变种或X4变种。同时使用两种共受体的菌株被称为双混合变异(D/M)。在HIV感染初期，HIV-1病毒利用CCR5进入。在疾病的后期阶段，病毒转换到CXCR4进入宿主细胞。
目前正在努力开发靶向辅受体并阻止病毒进入的分子。例如，maraviroc是一种CCR5辅受体拮抗剂药物，通过与CCR5受体结合来阻止HIV-1进入靶细胞。为了有效使用这种和其他CCR5激动剂药物，必须准确确定HIV-1辅受体的使用情况，because使用变体存在未检测到的次要CXCR4可导致随后的病毒学失败。2
问：基因型HIV-1向性研究与TTT表型进入试验相比如何？
SR:虽然重组病毒表型分析，如TTT，被认为是确定HIV-1倾向的金标准，但它们的常规使用由于成本高和周转时间长而受到阻碍。相比之下，NGS基因型HIV-1倾向测试简单、快速、廉价。然而，基因型检测在确定HIV非b亚型的趋向性方面往往表现不佳。
姬:V3 env区域的超深测序允许像表型方法一样检测低水平的CXCR4变异。
问:你们如何验证罗氏454系统的HIV-1趋向性分析方法?
姬:2010年，我们使用Roche 454 GS-Junior系统对HIV-1 V3 env区域进行了测序。为了验证该系统，我们严重依赖TTT表型细胞测试。我们得到的一致性很好，使我们能够建立解释算法。这些算法成为了为解释HIV-1倾向NGS数据而设计的PyroVir软件的基础。
“MiSeq系统的测序速度可以处理更多的样本。”
问:是什么促使你考虑使用其他NGS系统进行HIV-1倾向分析?
姬:当罗氏454技术生命周期宣告结束时，我们意识到测试其他NGS技术的重要性。随着罗氏454试剂将不再可用的消息传出，这是不可避免的。我们将注意力转向MiSeq系统。
问：您是如何进行比较研究的？
SR:利用来自抗逆转录病毒naïve研究对象的52份血浆样本，我们比较了MiSeq和Roche 454平台上的深度测序数据。我们使用我们的算法来解释来自每个系统的NGS数据，并确定HIV-1辅受体的使用。TTT作为参比分析。我们还验证了检测X4病毒的敏感性参数和定量这些变异的线性参数，使用20个病毒克隆。
问：你的对比研究结果如何？
SR:MiSeq系统在检测微小的X4变异方面很敏感，并且与TTT金标准检测HIV-1的趋向性密切相关。MiSeq和Roche 454系统检测微小CXCR4-using变异的灵敏度相似:MiSeq系统为5000 reads的灵敏度为0.26%，Roche 454系统为2000 reads的灵敏度为0.25%。
在确定定量小X4变异的灵敏度时，MiSeq系统比罗氏454系统（1-5%）更敏感（0.5-1%），可能是因为MiSeq系统获得了更多的读数。
两种NGS方法在对52个临床样本的分析中90%的结果一致，类似于两种表型方法预测HIV-1趋向性的一致性。两种NGS测定方法与TTT的一致性均高于70%。
MiSeq系统被证明对检测微小的X4变异很敏感，并且与TTT金标准检测HIV-1的趋向性很好地相关。”
问:对整个HIV-1包膜进行测序是否能提高对HIV-1倾向的预测?
SR:我们有一些合理的论据，即目前在V3 env区域确定的趋向性决定因素不足以获得最佳预测。我们认为，病毒包膜的其他区域参与了病毒进入的共受体。
姬:与基因型测定相反，TTT测定使用完整的包膜序列。新一代测序系统允许对完整的HIV-1包膜进行测序，以及基于其他区域分析的新算法，将改进对HIV-1辅受体使用的基因型预测。
目标是提高敏感性，包括各种亚型的敏感性。B亚型是美洲、西欧和澳大拉西亚的主要亚型。与鉴定X4病毒的参考试验相比，对B亚型的整个HIV-1包膜进行测序将提供更好的敏感性。它还将确定非洲非B亚型的倾向性更可靠的方式。
问:经过验证的基因型算法对特定病毒亚型的价值是什么?
SR:必须有适合病毒亚型的预测算法。从NGS获得的原始数据仍需进行分析，以预测病毒的倾向性。几年来，我们的目标一直是开发预测算法，以解释病毒亚型之间的取向差异。已经为最常见的HIV亚型开发了特定的算法，但为所有HIV亚型创建这些算法很重要。
问:与罗氏454相比，MiSeq系统的工作流程如何?
SR:MiSeq系统的样品制备步骤比Roche 454的制备步骤简单。由于操作较少，MiSeq系统运行之间的可变性也较小。罗氏454系统需要更有经验的技术人员。珠的分布质量和试剂的灵敏度存在问题。
“就性能和成本而言，MiSeq系统非常适合我们。”
问:MiSeq系统在病毒学研究方面有什么优势?
姬:MiSeq系统的测序速度使处理大量样品成为可能。对于核心实验室，需要优化每次运行的样本数量，以获得所需的读取数量。每个用户将决定每个系列的样本数量和分析深度。MiSeq流池提供了这种灵活性，可以在实验室中进行适应。就性能和成本而言，MiSeq系统非常适合我们。
问:你下一步的学习计划是什么?
姬:下一步是使用MiSeq系统获得准确的病毒种群定量，特别是使用CXCR4的病毒种群。通过最小的优化，我们已经有了良好的一致性。我们相信很快会有一个满意的结果。