靶向多基因测序面板可以快速、经济有效地发现变异

介绍

Franco Taroni医学博士是米兰Carlo Besta神经研究所（INCB）神经退行性疾病和代谢性疾病遗传学部门的负责人，他的团队在那里研究代谢和神经性疾病。25年来，他们利用Sanger测序进行研究，以确定罕见神经退行性疾病的分子基础，如小脑共济失调、痉挛性截瘫和遗传性神经病变。三年前，他的团队从Sanger转向MiSeq系统上的下一代靶向测序（NGS），开发了一个独特的工作流程，使用不同的靶向多基因面板来识别与这些神经退行性疾病相关的潜在遗传变异。

NGS使塔罗尼博士的团队能够在很短的时间内识别变异，而且比桑格测序的成本低得多。2016年，该团队发现了导致腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)的新突变，这是一种影响周围神经的遗传性神经疾病。^１－３他们也能够筛选许多患有小脑共济失调的受试者，以确定巨大基因的突变SYNE1．⁴塔罗尼博士的团队有几篇综述论文，重点是发现与脑白质营养不良和周围神经病变相关的新变异。

iccommunity采访了Taroni博士，介绍了他在研究中使用靶向多基因测序面板的情况，以及MiSeq系统是如何扩大和加速他的研究工作的。

医学博士Franco Taroni是意大利米兰Carlo Besta神经学研究所(INCB)神经退行性和代谢疾病遗传学部门的负责人。

问:关于神经和代谢疾病，你首先感兴趣的是什么?

佛朗哥电路(英尺):我在医学院接受过神经学家的培训。20世纪80年代初，当我开始在实验室工作时，我专注于神经和代谢疾病的生化和代谢方面。解决这些疾病带来的难题是一项令人兴奋的挑战。

问:卡洛·贝斯特神经学研究所的使命是什么?

英国《金融时报》:该研究所的研究重点是儿童和成人的神经和代谢紊乱。我们看到了一些罕见基因疾病的例子，我们试图通过测序来识别新的变异。

问:你们团队的研究重点是什么?

英国《金融时报》:我们的团队对脊髓小脑共济失调有长期的兴趣和专业知识，这是小脑和传入和传出通路的障碍导致运动障碍。这些疾病不同于帕金森氏症，因为除了震颤，还有运动缺乏协调性。

我们还关注痉挛性截瘫，这是一种皮质脊髓运动通路的障碍，以及影响中枢神经系统中髓鞘形成的周围神经和髓鞘障碍。神经系统疾病的特征是异质性的遗传病因，通常有超过50个基因负责每一种情况。例如，对于一个患有小脑功能障碍的患者，我们怀疑他患有遗传疾病，可能有超过80种不同的遗传原因导致了这种情况。

问:你们实验室使用桑格测序多长时间?

英国《金融时报》:我们从1989年开始使用Sanger测序，三年前收购MiSeq System后开始使用NGS测序。

问:是什么促使你从桑格测序转向NGS?

英国《金融时报》:神经和代谢疾病的异质性使我们考虑在我们的研究中使用NGS。多达90-100个基因可以导致我们正在研究的疾病的表型。通过桑格测序，我们一次只能检测7-12个基因。使用桑格测序分析80个基因是负担不起的。

NGS方法使我们能够同时有效地分析许多基因，帮助我们了解这些疾病的复杂性。我们现在使用Sanger测序来验证我们使用NGS识别的变异。

“使用NGS，分析一个样本中的200个基因大约需要两天时间。如果我们使用桑格测序，可能需要几个月才能完成相同的分析。”

问:为什么你们选择进行靶向多基因组检测而不是全基因组或外显子组研究?

英国《金融时报》:作为第一种方法，全基因组测序(WGS)研究对我们来说是昂贵的，在生物信息学上也很复杂。全外显子组测序(WES)的额外费用是不合理的，因为我们优先考虑的是建立一个几乎100%覆盖感兴趣基因的小组。我们选择创建5个针对不同疾病的目标测序面板，包括共济失调和痉挛性截瘫、神经病变、白质营养不良(中央髓鞘紊乱)、肌萎缩性侧索硬化症和癫痫。除了更便宜，靶向多基因小组检测消除了偶然发现的复杂问题。

问:你们用来识别与神经病学和代谢性疾病相关的变异的基于ngs的靶向测序工作流是什么?

英国《金融时报》:我们的NGS工作流程基于MiSeq系统，每次运行可以处理12至24个受试者样本。我们从一个廉价的、小的筛选面板开始，必要时转向更大的、有针对性的多基因面板。根据我们的目标基因数量，我们使用Nextera®XT DNA或Nextera快速捕获定制富集库准备试剂盒，为多基因面板准备样品。

首先，我们用几种最常突变的基因来筛查受试者所呈现的疾病。我们用这种靶向筛选方法捕获了25-35%的致病性变异。基因组的不同取决于我们想要分析的疾病或表型。例如，共济失调患者通常有4-6个常见的基因，这些是我们首先筛选的。对于这些狭窄的靶向多基因面板，我们使用Nextera XT DNA库准备试剂盒来准备受试者样本并创建扩增文库。

如果对这些基因的筛选是阴性的，我们就撒一张更大的网，用多基因面板进行第二轮靶向测序。每一组基因几乎包含与特定疾病相关的所有基因(每组70-200个基因)。例如，共济失调的一个小组包括所有已知的导致共济失调的主要症状的基因。白质营养不良组包括所有导致中枢神经系统脱髓鞘的基因，等等。对于这些广泛靶向的多基因面板，我们使用Nextera快速捕获定制富集试剂盒。这个试剂盒是有用的，特别是当主体有连续性的表型与许多基因涉及。例如，患有共济失调的人可能也有痉挛性截瘫的特征，反之亦然。有一个单独的面板，而不是两个独立的面板来测试各种疾病基因，这是一个优势。利用Nextera快速捕获自定义富集技术，我们还可以分析复制数量的变化，使我们能够精确定位可能导致疾病的缺失或重复。

如果我们不能利用疾病面板确定疾病变异的存在，我们就会转向外显子组测序，以更广泛地确定感兴趣的变异。

“根据我们的目标基因数量，我们使用Nextera XT DNA或Nextera Rapid Capture Custom Enrichment Library Prep Kits为多基因图谱准备样本。”

问:你如何将新基因纳入你的面板?

英国《金融时报》:我们的面板会定期重新设计。每次我们重新排列它们，我们就有机会添加我们和其他人可能在研究中发现的新基因。虽然Nextera快速捕获自定义富集试剂盒允许许多基因，但我们有时不得不取出一些基因，为新的基因腾出空间。

问:你们为什么选择MiSeq系统来进行你们的靶向重测序研究?

英国《金融时报》:我们选择MiSeq系统是基于我们的预算和它在数据质量方面的可靠性，特别是通过长时间重复碱基的测序。该系统的速度和多功能性也是我们做出决定的因素之一。

问:你如何分析数据?

英国《金融时报》:数据分析从VariantStudio Software开始。然后，数据进入一个管道，其中包括一些公共可用的商业软件，如CLC基因组学工作台和数据库。我们使用Database来过滤变异，以及其他一些工具，包括EVS, HGMB, ExAC和1000 Genome。

我们建立了自己的本地数据库来研究在意大利人群中发现的变异。大多数公共数据库是基于北美或盎格鲁-撒克逊基因型。我们的数据库有效地解决了意大利多态性分布的变异性，这对生物信息学分析很重要。

利用生物信息学工具分析变异的功能效应，如筛选不耐和耐受性(SIFT)和多态性表型(PolyPhen)用于氨基酸替换，NNSplice和替代剪接位点预测器(ASSP)用于RNA剪接。在体外通常需要对蛋白质和RNA水平的功能评估来验证在网上预测。尽管我们尝试使用湿实验室技术来验证变异，但这并不总是可能的。对于我们要评估的特定基因，通常没有功能分析。

问:与使用Sanger测序来识别变异相比，MiSeq系统中基于ngs的面板的产量和周转时间如何?

英国《金融时报》:NGS在分析的基因数量和输出报告和分析的复杂性上都优于Sanger测序。在桑格时代，我们一次只能对一个基因进行测序，并对该特定基因的特定测序部分生成一份报告。周转时间很长，我们只能对有限数量的基因进行测序。

使用NGS，分析一个样本的200个基因大约需要两天时间。如果我们使用桑格测序，可能需要几个月才能完成相同的分析。

“我们已经使用MiSeq系统的靶向测序过程快速识别了新的基因和表型。”

问:在这个过程中你发现了哪些基因?

英国《金融时报》:我们利用MiSeq系统的靶向测序过程快速识别了新的基因和表型。我们设计的面板尽可能具有包容性，这意味着它们甚至包括引起特定表现型兴趣的不常见基因。有时我们会遇到意想不到的结果，比如基因突变，通常是由于表型不同于突变在受试者样本中的表现。在这些情况下，我们在已知基因中发现了一种新的表现型。

在两个病例中，我们通过外显子组测序确定了新的基因。这些样本来自于髓磷脂紊乱的受试者，在最初的筛选和面板测序中均为阴性。这种突变相对较少。我们正在完成对这两个基因的研究，这项工作尚未发表。发现与表现型相关的新基因总是很有趣的。

我们还在撰写两篇论文，报告了有趣案例的结果，在这些案例中，我们发现了许多与白质营养不良和周围神经病变相关的突变。对于患有罕见疾病的受试者来说，不知道疾病的原因是非常令人沮丧的。因此，提高我们的潜在分析率非常重要。

问:您的实验室如何看待从桑格到NGS的转变?

英国《金融时报》:从桑格到NGS的转变是一个巨大的变化。NGS更为复杂，并不是所有人都以完全自主的方式使用这项新技术。我们团队中相对较少的成员准备了Nextera Rapid Capture库或分析了结果，但许多人已经创建了Nextera XT库并进行了测序运行。它改变了我们实验室的文化以及人们看待这个系统可能性的方式。

问:你下一步的研究是什么?

英国《金融时报》:我们希望与临床医生合作，从患者、家庭成员和其他亲属那里获取样本，并创建一个结果数据库。这会对我们的研究产生重大影响。它将使我们拥有意大利人群中正常和病理变异的详细数据库，从而增强测序项目的过滤能力。这不是我们自己能做的事情，因为我们不直接和病人打交道。

我们刚刚加入了一个欧洲项目，名为“超越外显子组”。该项目的范围是将不同的研究方法(RNA测序/转录组学、蛋白质组学和WGS)整合到已经进行了外显子组测序的未解决病例中。我们将把我们的测序研究扩展到单细胞并进行功能分析。我们期待在NextSeq上表演RNA-Seq®500系统。

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