英国实验室使用SNP阵列加速和增强细胞遗传学分析

介绍

他在英国纽卡斯尔泰恩医院的北方遗传学服务中心工作了近30年，¹临床细胞遗传学家Simon Andrew Zwoliński博士使用了广泛的细胞遗传学技术。他主要研究出生后样本，对其方法的及时性和准确性非常敏感*

Zwoliński博士一直对他在工作中使用的方法和技术的发展持开放态度。他的职业生涯始于g波段和荧光原位杂交（FISH），转移到细菌人工染色体（BAC）比较基因组杂交（CGH）阵列，然后是寡核苷酸阵列。2015年，他开始对基于SNP的阵列感兴趣。在比较Illumina CytoSNP-850K珠芯片与安捷伦CGH+SNP和Affymetrix CytoScan SNP阵列后，他选择了Infinium CytoSNP-850K珠芯片。他的团队在NextSeq上验证了阵列®550系统，并在一个月内顺利过渡到使用CytoSNP-850K BeadChip。

我社区与Zwoliński博士讨论了CytoSNP-850K BeadChip的有益品质以及它如何提高了他的团队的效率。

西蒙·安德鲁Zwoliński博士是英国纽卡斯尔泰恩医院北方遗传学服务中心的产后细胞遗传学和阵列主任。

问：是什么激发了你对遗传学的兴趣？

西蒙·安德鲁Zwoliński (SAZ):我最初是一名植物学家，专门研究植物育种和作物进化。然后，我在伯明翰获得了应用遗传学的科学硕士学位，并在伦敦帝国理工学院获得了纯遗传学博士学位。我着迷于预测人类减数分裂分离模式的能力Ascobolus浸泡．

问：在你的职业生涯中，经历了技术的所有变化是什么样的？

萨兹：当我开始我的职业生涯时，全是孟德尔遗传学。然后人们开始识别DNA序列，不久之后整个人类基因组都被测序了。这对诊断遗传学有着深远的影响。进行细胞遗传学就像“发现差异”，在光学显微镜下寻找微小的变化。如今，细胞遗传学是基于计算机的，我们正在解释拷贝数变化的实际基因内容。如今，大多数临床科学家甚至都不考虑孟德尔遗传学，对此我感到有点难过。

问：新一代测序（NGS）等新技术如何帮助识别与先前未知的遗传综合征相关的变异？

萨兹：NGS已经识别了致病基因和相关表型，所以现在我们可以在阵列解释中使用这些信息。

问:在过去几年里，这些发现的速度增加了吗?

萨兹：发现的速度呈指数级增长。当我们在2006年第一次开始使用数组时，我们可以识别出大约20种症状。我们现在正在研究500种可以用数组识别的症状，其中一些还没有命名。

问：你今天在实验室做了哪些类型的细胞遗传学检测？

萨兹：目前，我们仍在进行g显带，以寻找平衡的重排，并使用FISH和一些类型的细胞遗传学检测染色技术。然而，我们现在的大部分工作都是关于SNP数组。

问:您所使用的每种细胞遗传学检测技术的优缺点是什么?

萨兹：当我在1988年开始工作时，我们所能得到的只有G-带和一种叫做C-带的方法。这是一个完整的基因组屏幕，但它捕获的信息却很粗糙。我们正在考虑一个大约5兆碱基的分辨率。我们的异常识别率低于5%。随着我们对FISH的研究进展，我们只知道样本是否代表了一种特定的综合征。鱼不会给出比“是”或“否”更多的信息

然后，我们与许多其他技术合作，这些技术来去很快。其中一种被称为M-FISH，它为每个染色体分配不同的颜色，这样我们就可以看到G-带所看不到的易位。我们还尝试了多重连接依赖性探针扩增（MLPA）用于端粒重排。

我们于2006年开始使用BAC阵列，并于2010年转移到低聚阵列。2016年，我们过渡到SNP阵列，这些是迄今为止用于确定异常的最强大和最准确的阵列。根据我们的经验，我们发现使用G-带检测发现异常的几率为1/20。随着新技术的引入，我们发现异常的机会增加了。通过CytoSNP-850K阵列，我们现在找到了四分之一样本的答案。这是一个显著的区别。

问：SNP阵列提供了哪些寡头CGH阵列无法提供的功能？

萨兹：寡核苷酸阵列和BAC阵列只能识别拷贝数变化，而SNP阵列可以识别拷贝中性变化，如单亲二体（UPD）、杂合性缺失和杂合性缺失。SNP阵列是功能强大的工具，不需要额外的工作就可以获得额外的信息。

“CytoSNP-850K阵列非常好，看起来非常可靠和一致，我们只用了四周就完成了过渡。”

问:你考虑过什么SNP阵列?

萨兹：我们调查了所有商业SNP阵列供应商，包括安捷伦、Affymetrix和Illumina。我们选择了CytoSNP-850K BeadChip，因为我们认为它是分辨率、设计和成本方面最好的平台。根据我们过去的经验，我们也知道Illumina是可靠的，我们与该公司关系良好。

我们做出决定的另一个因素是蓝保险丝®我们已经很熟悉用于分析SNP阵列的多软件。这是一个重要的卖点，因为该软件质量高，用户友好。

问:你们是如何过渡到CytoSNP-850K珠晶片的?

萨兹：当我们决定改用CytoSNP-850K BeadChip时，我们开了大约三个月的会，说服我们研究所的经理们，从寡核苷酸阵列过渡到SNP阵列是一个很好的决定。

我估计，验证阵列平台需要大约8周时间，同时运行oligo和SNP阵列需要4周时间。我认为这是过渡和训练我们团队所需的时间长度。然而，CytoSNP-850K数组执行得如此可靠和一致，以至于我们在仅仅四周内就完成了转换。2016年2月，我们使用寡聚阵列，到2016年3月初，我们只使用SNP阵列。

“我们现在发现了寡核苷酸阵列无法识别的SNP异常。”

问：您是如何验证CytoSNP-850K BeadChip的？

萨兹：为了验证CytoSNP-850K阵列，我们运行了32个历史异常样本。在每种情况下，SNP阵列不仅检测到异常，而且在确定断点方面比寡核苷酸阵列精确得多。这些异常的大小都在我们从低聚物阵列估计的最小值和最大值之间。这些数据验证了SNP阵列，并向我们展示了寡核苷酸阵列最初在提供一系列大小方面有多好。

当我们选择这32个原始样本时，我们确保它们代表了一系列的遗传异常，包括缺失、重复和三次重复。我们还选择了无染色体，三染色体，非常小的异常，以及已知的男性和女性性染色体异常的样本。偶尔，即使在32个样本中，我们也会发现比我们从寡聚阵列中获得的信息更多。一些拷贝数变化在寡聚体阵列上看起来很简单，但在CytoSNP-850K阵列上却很复杂。

问：您在CytoSNP-850K BeadChip验证研究中使用了哪些组织类型？

萨兹：我们主要使用血液，也对恶性肿瘤样本进行验证。特别是，我们观察了使用这两种技术的致癌基因扩增是什么样的。此外，我们分析了一些胎盘样本，其中我们知道有母细胞污染，这很容易被CytoSNP-850K BeadChip检测到。我们还分析了一些产前样本，以确保这项技术适用于我们常规使用的所有组织类型。

问：验证研究花了多长时间？

因为CytoSNP-850kbeadchip非常好，能够精确地识别基因异常，所以我们只花了三周时间验证了该阵列。寡核苷酸和单核苷酸多态性阵列并行运行了几周，但是我们几乎没有观察寡核苷酸，因为我们对CytoSNP-850K珠芯片数据非常有信心。

我们保存了一些低聚物玻片和一些试剂，以备我们需要。最后，我们意识到我们不会再使用它们了，所以我们把它们提供给另一个仍在使用寡头阵列的实验室。目前，我们无意重新使用低聚阵列。

问:让您的团队熟悉运行NextSeq 550 System和CytoSNP-850K BeadChip需要多长时间的培训?

萨兹：Illumina的工作人员非常棒，他们用了两周的时间来训练我们进行实际的设置和分析。值得注意的是，我们的团队很快就掌握了工作流。我们没有遇到任何问题，并且在过去的几个月里训练了整个团队。

成功过渡到CytoSNP-850K BeadChip的一个显著好处是减少了所需的实际操作时间。我们每周用CytoSNP-850K芯片分析64-128个样本。如果我们试图用寡头阵列进行那么多分析，我们根本就没有人力。即使每周只有64个样本，也至少需要三个人来使用寡头阵列进行分析。

“Illumina的工作人员非常出色，在两周的时间里对我们进行了实际设置和分析方面的培训。值得注意的是，我们的团队很快就掌握了工作流程。”

问:在分辨率方面，CytoSNP-850K BeadChip的结果与aCGH的结果比较如何?

萨兹：这两种技术之间的差异是显著的。由于国际细胞基因组学标准(ISCA) v2寡核苷酸阵列设计，许多综合征没有得到很好的覆盖。SNP阵列的一个积极的方面是，它们被设计为包括所有已知的综合症和每个目标基因。我们现在发现了SNP异常，这是我们无法通过寡核苷酸阵列识别的。

问：寡核苷酸和单核苷酸多态性阵列对DNA浓度的要求有差异吗？

萨兹：这是有区别的，但它并没有对我们产生影响。我们过去花了大量时间清理寡聚物阵列的DNA，我们不再需要这样做了。我们正在用CytoSNP-850K珠芯片处理样本，就像它们从机器人上下来一样，这节省了大量的工作和时间。因此，我们的周转时间有所改善。

问:你能用CytoSNP-850K珠晶片检测杂合性缺失吗?

萨兹：CytoSNP-850K BeadChip为我们提供了更准确的拷贝数变化和拷贝中性变化的测定。了解等位基因频率和关于杂合性的深入信息很有用。当我们有一个删除或重复时，SNP阵列提供内置的确认，我们可以通过log R比率看到这一点。当我们使用寡头阵列分析样本时，我们意识到软件发出的大多数调用都不是真实的。根据我们在研究对象队列中看到呼叫的次数，我们不得不猜测它们不是真的。当我们今天进行SNP阵列时，我们可以通过B等位基因频率来判断它是否真实，这给了我们对结果的信心。此外，对于某些综合征区域，CytoSNP-850K珠芯片上有100多个阵列特征，而寡核苷酸阵列上只有三到四个特征。

问：用CytoSNP-850K串珠芯片和寡核苷酸阵列检测扩增或镶嵌是否有差异？

萨兹：当我们使用寡核苷酸阵列时，我们希望看到理论上的对数2比率，重复为+0.6，删除为-1.0。然而，这只是一个理论值，并且总是存在一定程度的变化。有时我们会得到一个log2比率，不是+0.6或-1.0，这会给我们一个关于镶嵌的线索，但我们只能通过FISH来证实这一点。现在我们可以通过B等位基因频率的偏差清楚地识别镶嵌和多拷贝。

很难知道马赛克的精确程度，但我估计我们已经确定了低于10%的缺失水平。有了这些复制品，马赛克的检测就困难多了，我猜我们能看到大约20%的水平。对于多个拷贝，我们可以通过观察B等位基因频率图的不同模式来知道有多少个。

“我们每周用CytoSNP-850K BeadChip分析64-128个样本。如果我们试图用寡聚阵列进行这么多的分析，我们根本就没有人力。”

问：您对过渡到CytoSNP-850K BeadChip有任何担心吗？

萨兹：当我们转移到CytoSNP-850K BeadChip时，我们担心的一件事是我们可能获得的调用数量的增加。实际上，调用的数量与我们用寡聚数组获得的没有什么不同。不同的是，在使用CytoSNP-850K BeadChip时，几乎所有的调用都是真实的。很容易判断它们是良性的还是致病的，因为良性的基因通常位于没有显著基因或外显子的地方。

虽然SNP阵列可以识别某些综合征的UPD或杂合性缺失，如Prader-Willi、Russell Silver或Beckwith-Wiedermann，但我们也发现了不显著的整条染色体UPD。这需要敏感的报告，我们仍处于学习曲线上。我们还关注血缘关系的识别，这可能是一个问题只有父母中的一方知道。yobet亚洲

问:你们实验室的下一步是什么?

萨兹：我们将专注于巩固我们与CytoSNP-850K阵列的工作，并开始使用NextSeq 550系统对恶性肿瘤样本的基因面板进行测序。在未来，我们希望NGS将帮助我们检测与孤独症和癫痫相关的基因变异。

当我们转向SNP阵列时，大学里的各种研究小组都要求我们提供SNP服务来分析细胞系。在过去，他们要么没有对他们的细胞系进行阵列分析，要么把它们送到昂贵的私人服务公司。

我们预计每年进行2000例细胞遗传学分析，自从我们开始使用SNP阵列以来，在8个月内我们已经进行了2000多例。我们已经提高了吞吐量和效率，对此我们感到很高兴!

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