在高片段RNA样本中识别lncRNA生物标志物
优化NextSeq 500系统和TruSeq RNA外显子试剂盒lncRNA生物标志物鉴定的RNA测序工作流程。
在高片段RNA样本中识别lncRNA生物标志物
总结
概述
Biogazelle执行捕获RNA-Seq来识别FFPE和液体活检癌样本中的lncRNAs和mRNA突变。
挑战
FFPE和液体活检样本结合了超低输入和高片段RNA的挑战。
解决方案
Biogazelle选择了NextSeq 500系统和TruSeq RNA外显子文库准备试剂盒。该公司与Illumina合作，优化捕获RNA-Seq工作流程，开发定制探针，并实施独特的捕获流程。
好处
Biogazelle可以用几毫微克的总RNA进行精确和敏感的lncRNA测量，甚至从FFPE和液体活检样本。
介绍
Jo Vandesompele博士在2007年创立了Biogazelle。该公司为制药、生物技术和临床研究人员提供转录组分析和实验设计服务。其服务范围包括:通过定制的RNA定量研究发现和验证RNA生物标志物;高通量反义寡核苷酸筛选;长编码RNA (lncRNA)靶标的识别、测量和沉默;并协助客户进行先导药物发现和临床前研究。
非编码RNA研究是Biogazelle肿瘤学研究的核心。有些癌细胞似乎对某些lncrna的存在上瘾，当转录本被沉默时就会死亡。1使用福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)和液体活检样本可能很困难，因为这些癌症样本的输入量低，且高度碎片化。Biogazelle使用NextSeq 500 System和TruSeq RNA外显子试剂盒进行RNA- seq，从这些样本中获取最多的信息。
Jo Vandesompele博士，根特大学教授，Biogazelle联合创始人和首席科学官。
充分利用高度碎片化的样本
根据Vandesompele教授的说法，没有比NextSeq 500系统更好的rna测序仪器了。Vandesompele教授说:“它具有我们执行全rna测序所需的能力、灵活性和规模。”“在支持多种图书馆类型方面，它也非常宽容。”
这些癌症标本极有价值。Vandesompele教授补充说:“我们的客户和合作伙伴不想为了一种需要一微克甚至100毫微克RNA的方法而牺牲生物材料。”
Biogazelle与Illumina合作，以减少各种RNA-Seq应用所需的样品量。Vandesompele教授说:“我们正在寻找关于样本多小才能成功进行rna测序的答案。”“10纳米能行吗?”1纳克怎么样?我们能否对无法可靠测量RNA浓度的液体活检样本进行测序?令人惊讶的是，通过一些简单而巧妙的修改，它并不困难。我们可以用几毫微克的总RNA或200µl的生物液进行精确而敏感的RNA测量。2我们非常感谢Illumina团队的支持，使我们能够实现这一目标。”
NextSeq 500系统“拥有执行全部rna测序所需的容量、灵活性和规模。在支持多种图书馆类型方面，它也非常宽容。”
克服的挑战
TruSeq RNA外显子文库准备试剂盒提供了一个“伟大的解决方案”，以解决FFPE和液体活检样品，结合超低输入和高度片段RNA的挑战。它将总RNA转化为已知链起源的模板分子，然后对感兴趣的外显子进行序列捕获。Vandesompele教授说:“其他的全RNA准备方法消耗了内含子上的许多没有意义的读取，产生的数据质量较低。”“基于RNA外显子组探针的捕获方法非常优秀，效果非常好。”
RNA外显子组的一个限制是探针只针对蛋白质编码基因。Vandesompele教授解释说:“当我们进行全rna测序时，lncrna几乎处于噪音水平，95%的读取信息会进入高度丰富的编码蛋白基因。”“作为解决方案，Illumina使用了我们在根特大学创建的全面的人类LNCipedia数据库，开发针对所有人的定制探针。3.在试剂盒中添加针对这些低含量、具有挑战性的lncrna的定制探针，使我们能够进行奇妙的实验。这也为我们的客户提供了许多学习以前无法学习的东西的可能性，这很好。”
“基于RNA外显子组探针的捕获方法非常优秀，效果非常好。”
修改低输入样本的工作流
TruSeq RNA外显子组是处理低输入量的好技术，Biogazelle根据RNA分子做了一些工作流程的修改。Vandesompele教授说:“对于低RNA输入量，我们采用了几种不同的方法，比如通过浓缩样本来增加输入量。”
Biogazelle团队发现，在用TruSeq RNA外显子捕获之前的多路复用是液体活检的一个问题。Vandesompele教授补充说:“由于RNA的含量不同，我们的库永远不会是等摩尔的。”“我们对每个样本执行单独的捕获，而不是预捕获多路复用。这需要更多的工作，但数据明显更好，而且库是等摩尔的。”
“lncrna在肿瘤学、神经学和其他疾病领域提供了前景。我们正处于一种全新医学的开端。”
高价值RNA-Seq肿瘤研究
Vandesompele教授认为，RNA-Seq数据提供了与DNA测序相同甚至更多的信息数据。49000个高可信度lncRNA基因与21000个蛋白编码基因相比，其生物标志物潜力明显更大。然而，它的价值可能在于同时观察RNA和DNA信号来评估癌症或其他疾病。“lncrna在肿瘤学、神经学和其他疾病领域提供了希望，”Vandesompele教授说。“我们正处于一种全新医学的开端。”
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参考文献
- Huarte M和Rinn JL。大型非编码rna:癌症的缺失环节?哼摩尔麝猫．2010; 19:152 - 161。
- Biogazelle。专业知识/液体活检。www.biogazelle.com/expertise/liquid-biopsies．访问。2019年6月17日
- LNCipedia。人类长链非编码rna的综合概要。lncipedia.org/．已于2019年5月28日生效。