解读长期非编码RNA在癌症中的作用
研究人员正在使用RNA-Seq揭示lncRNAs如何用于识别、测量和治疗癌症。
解读长期非编码RNA在癌症中的作用
介绍
Jo Vandesompele博士对RNA有特别的亲和力。这始于他的博士论文研究，他使用逆转录酶定量PCR (RT-qPCR)研究RNA在神经母细胞瘤中的作用。从那以后他就迷上了RNA。这是他在根特大学(Ghent University)的功能癌症基因组学小组和他于2007年创建的公司Biogazelle的重点，该公司提供RNA分析和实验设计服务。
“我认为RNA是一个迷人的分子，”Vandesompele教授说。他成为在会议上听到关于它后的特定类型的RNA，长期非编码RNA（LNCRNA）的激光。LNCRNA被认为负责人体中的大量专业细胞，并协调细胞如何转录组织。某些癌细胞似乎沉迷于某些LNCRNA的存在，并且当转录物沉默时死亡。“我们立即认识到LNCRNA的力量，并开始使用不同的图书馆预备方法进行研究，以研究这些成绩单及其在各种癌症中的作用，”Vandesompele教授补充说。“我们在跟特大学和Biogazelle的团队被公认为是LNCRNA的世界专家。”
iCommunity与Vandesompele教授在了解癌症谈到lncRNAs的价值与单纯注重DNA标记，以及他们如何被用作开发新的癌症诊断和治疗的目标。亚博下载app我们还讨论了它们是如何使用NextSeq™500系统和TruSeq™RNA外显子组，以确定高度分散的样品，如福尔马林固定的，石蜡包埋（FFPE）组织样品和液体活检在RNA标记。
Jo Vandesompele博士是根特大学的教授，也是Biogazole的联合创始人和首席科学官。
问：是什么引发了对RNA的兴趣，具体而言，LNCRNA？
Jo Vandesompele（合资公司）：当我在Grad学校进行神经母细胞瘤研究时，我对RNA感兴趣。我想进入原产的细胞，它们是稀有细胞。北方印迹和微阵列需要太多的RNA，因此我使用了RT-QPCR，这是当时的新方法。
我在2009年在2009年举行了一场Keystone会议，当时我第一次学习了LNCRNA。yobet亚洲此时，已识别出约1700个LNCRNA序列。我们认识到LNCRNA作为生物标志物的力量，并设计了QPCR测定以量化它们。通过我们的努力和全球研究人员，LNCRNA数据库增长至4000，以后至18,000次序列。
问:你们用什么技术来研究lncrna ?
珍:随着lncRNA数据库的增长，很明显qPCR不再是一种有效的分析方法。我们设计了一个微阵列，然后使用不同的文库制备方法过渡到总RNA-Seq。当时并没有很多研究人员进行全rna测序，今天仍然如此。大多数研究人员依赖polyA RNA- seq，即使它只捕获有polyA尾部的RNA。我们估计有一半的lncrna没有这样的尾部。
问：lncRNA在人体中的作用是什么？
珍:我们只是表面了解人体lncRNA的作用。当我们进行实验，正在出现的主题之一是lncRNA的极端组织和细胞类型特异性。看来，lncRNAs或许可以解释人类生活的复杂性。虽然苍蝇，西红柿，和人类有很大的不同，他们几乎相同数量的蛋白质编码基因。然而，人类是远了许多专门的细胞类型整个身体更加复杂。研究人员曾认为这是由于选择性剪接或翻译后的蛋白质修饰。这也许是对在一定程度上。然而，lncRNAs发挥编排细胞如何从转录调控角度组织了有益的作用已经很清楚。我们认为，lncRNAs充当胶，无论是使蛋白质的DNA，或附连蛋白RNA，或胶合不同RNA分子汇集成的支架。另一种可能性是，他们滴定的重要分子远离那些他们不应该或给他们带来他们需要的是一个位置。
“可以利用LNCRNA的表达特异性来揭示细胞的状态。”
问:lncrna能告诉我们关于细胞状态的什么信息?
珍:lncRNAs的表达特异性可以用来揭示细胞的状态。到目前为止，已经鉴定出大约50000个lncRNAs，而且这个数字还在增长。lncRNAs在表达的时间和位置上非常特异，在任何给定的细胞类型中只表达一小部分。一旦我们弄清楚特定lncRNA在何时何地表达的代码，我们就可以确定细胞类型和细胞状态，比如它是健康的还是患病的。通过研究这些细胞类型特异性，我们可以学到很多东西。yobet亚洲
问:lncrna如何作为生物标志物用于诊断和治疗?
珍:如果一个lncRNA在一个特定的细胞或组织中特异表达，那么它在该细胞中必定具有重要的功能是合乎逻辑的。事实证明，一些细胞，尤其是某些癌细胞，对存在的lncrna上瘾。我们发现的第一批lncRNAs之一是SAMMSON，它只在皮肤黑色素瘤中表达。与合作者一起，我们发现沉默SAMMSON会破坏某些线粒体功能，杀死癌细胞。1
SAMMSON是数百种癌细胞类型特异性的lncrna中的一种，如果我们移除它，癌细胞就会不高兴，不再增殖或死亡。我们可以对lncrna进行合理的药物设计，开发治疗方法，同时有配套的诊断。如果我们知道了lncRNA序列，并能设计出测量它的方法，我们就能识别对这些lncRNA上瘾的疾病或癌细胞，并使用沉默技术关闭它们。基于CRISPR和sirna的方法正在开发中。反义核苷酸是最先进的，为开发lncrna靶向治疗提供了一种有前景的方法。
lncrna在肿瘤学、神经学和其他疾病领域提供了前景。市面上有屈指可数的反义药物，如inotersen、nusinersen、eteplirsen和mipomersen，还有超过100个评估反义寡核苷酸的临床试验。这类药物易于管理，并通过减少RNA或修改剪接而起作用。2我们正处于一种全新药物的开端。
问：你在跟特大学表演的LNCRNA研究类型是什么？
珍:虽然我们最初关注的是儿童癌症，但我们意识到我们的技术可以应用于所有类型的癌症。我们现在专注于十几种癌症，包括前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、食道癌、肺癌和成神经细胞瘤。我们正在努力扩大研究范围，并与专家合作者和关键意见领袖合作推进这些研究。
“大多数研究人员依赖polyA RNA- seq，即使它只捕获有polyA尾部的RNA。我们估计有一半的lncrna没有这样的尾部。”
问：Biogazelle客户群的化妆是什么？您提供的服务？
珍:我们主要的工作与制药，生物技术和临床研究人员。我们提供的A到服务的广度ž从RNA生物标志物的发现通过定制RNA定量研究，以进行高通量的反义寡核苷酸筛选，识别，测量和沉默lncRNA的目标，并协助客户与铅药物发现和临床前研究。
我们不只是向客户提供数据。我们协助他们通过项目思考，提供可操作的见解和结果，以便他们可以继续。我们有博士级项目经理，参与所有项目讨论和协助实验设计。我们在质量控制的环境中应用我们的方法，是ISO 17025认可，可以在良好的临床实验室实践（GCLP）标准下工作，这对我们的制药客户非常重要。
我们还有一个研究部门，经常与Illumina进行交流。该团队专注于开发新的RNA定量方法，使我们的客户能够做以前不可能的事情，特别是在液体活检空间。
问：你什么时候开始利用Illumina NGS系统？
珍:跟根大学的第一个NGS系统是罗氏454系统。我们仅用于DNA分析。人们抱怨说，使用很困难和昂贵。在同一时间，我们购买了一个Genome分析仪™2系统。2014年，我们中心的诊断实验室获得了MiSeq™ 系统。他们对它非常满意，认为它很容易使用，价格也很便宜。大约在同一时间，Biogozelle团队购买了NextSeq 500系统来执行RNA Seq。从那以后，我们又购买了第二套NextSeq 500系统。
问：你分析了哪些类型的样品？
珍:大多数样本是我们分析是高度分散的癌症样本，如FFPE组织样本和液体活检。3.TruSeq RNA外显子组是解决FFPE和液体活检样本的一个伟大的解决方案，结合超低输入和高度片段RNA的挑战。它将总RNA转化为已知链源的模板分子，然后对编码RNA进行序列捕获。其他的全RNA制备方法会消耗许多内含子上的读值，这些读值并不总是有意义的，产生的数据质量也较低。
问:样品处理后，如何判断是否有足够的数据?
珍:在每一步，我们都进行质量控制(QC)。在样品接收时，我们会检查样品的数量，以确定它与客户在标签上的说明一致。对于FFPE样品，我们根据纯度和完整性进行定量。不幸的是，对于液体活检，我们一开始无法获得完整性或纯度，因为水平太低了。我们第一次可以在液体活组织检查中验证这些是当我们预先捕获cDNA，在片段分析仪上查看预先纯化的文库时。这可以通过任何微流体设备进行评估，90%以上的时间它都能工作。有时我们必须重复分析，以确保我们有足够的RNA。
在浓缩和库净化后，我们在集中执行另一个QC，以确保我们有等摩尔汇总。经过那些QC步骤后，我们在NextSeq 500系统上执行RNA-SEQ以获得高质量数据。
生成高质量数据非常重要。许多服务提供商不意识到的是排序中发生批量效应。为了避免他们，我们学会了争夺并随机化样本。yobet亚洲当客户发送我们的样本时，总有一个特定的顺序。因此，我们在提取过程中随机化样本接收，以及在图书馆准备期间，以消除批量效应。我们还确保我们具有质量和批量控制的试剂，因此我们不会引入批处理效果。从排序的角度来看，我们尝试扩展索引的数量，以尽可能多的样本。对于几乎所有的图书馆，我们现在拥有多达96个索引，以及一些应用程序（例如，3'-End Sequencing）甚至更高。
“如果我们知道lncRNA序列并能够设计检测方法来测量它，我们就可以识别对这些lncRNA上瘾的疾病或癌细胞，并使用沉默技术将其关闭。”
问：您使用RNA-SEQ是否识别样本中存在的突变？
珍:我们很想确定癌症标本中存在的突变，以及剪接变异体和基因融合，但许多人是保守的，希望我们只进行基因水平的量化。
这有点不幸，因为他们没有进入RNA-SEQ数据的丰富性。例如，替代拼接易于检测。此外，现在具有一种名为圆形RNA（CircrNA）的新型拼接，所述循环RNA（CircrNA）起源于后剪接。三篇近三篇论文将CircrNA作为治疗目标或新型生物标志物的潜力记录。4 - 6CircrNA不能用经典的Polya测序鉴定，因为它们没有多达尾巴，这可能是为什么人们没有注意他们。
我们正在推动技术，看看我们还可以识别RNA-SEQ数据中的其他突变。客户了解DNA水平的价值。它是RNA水平的不同球比赛。例如，RNA编辑是一种混淆，但有趣，现象。我认为我们刚刚开始了解RNA编辑在疾病生物学中的重要性。然而，RNA的动态范围是问题，因为覆盖范围取决于每个基因的表达水平。如果我们想以体面的灵敏度水平检测低频突变，我们需要30×低丰收的RNA覆盖。用顶部丰富的基因读取所有测序读取。
问:RNA编辑有哪些可能的应用?
珍:RNA编辑在评估肿瘤突变负荷(TMB)中具有重要价值。TMB测量癌细胞携带的所有突变，对于预测免疫肿瘤治疗的应答或缺乏应答非常重要。
研究人员一直在DNA水平上研究TMB，可能是因为它太简单了。虽然这是RNA的一个挑战，但它是可行的和有价值的。高TMB的肿瘤细胞具有更多的新抗原，这些新抗原可以被免疫系统识别，从而引发抗肿瘤反应。在RNA- seq数据中发现的表达的非同义突变可能导致新抗原，RNA编辑作为新抗原的额外来源。
我们初步的数据显示，有什么之间，我们称之为表示TMB（eTMB）和基于DNA的TMB得分很强的相关性。我们正在与合作伙伴合作，与临床数据进行大规模的研究表明，如果我们结合从RNA编辑产生的新抗原的表达的变体，我们可能有一个更好的预测为应对检查点抑制剂。测定灵敏度不会像重要的，因为TMB得分是每蛋白质编码基因的兆碱基测序非同义突变的数量。目前TMB液体活检方法看只有几百个基因。随着RNA-Seq的，我们可以看到更多的基因，从而产生更丰富的数据。我们看到在利用RNA对这种类型的分析显著潜力。
“RNA编辑可能是评估肿瘤突变负担（TMB）的价值。”
问：Biogazelle还提供有助于临床前研究的公司吗？
珍:当我们将RNA测序应用于我们的发现项目时，我们将转向qPCR来开发用于临床前研究的诊断分析，并作为一种伴生分析。在其中一个开发阶段，我们使用与RNA-Seq发现研究相同的样本，以确保我们可以使用qPCR作为正交验证方法复制研究结果。我们的大多数客户和合作伙伴想要临床级检测，通常qPCR是足够好的。这种情况在未来可能会改变，但现在使用测序的RNA临床分析并不多。利用qPCR，我们可以建立一个有质量控制的临床级诊断试剂盒。
问：您执行哪些类型的数据分析？
珍:我们首先进行差异基因表达分析，比较样品或样品组。然后，我们超越这种经典的方式来看RNA，使用两种先进的生物信息方法评估基因签名。首先是使用广泛研究所的基因集浓缩分析算法进行基因设定富集分析。它可以通过折叠变化差异或p值来排序基因。它是一种稳健而敏感的计算方法，可以辨别微妙的模式。它可以揭示基因集或通路级信息，使我们能够了解示例组中发生的内容。
第二种方法是反褶积分析，用于估计RNA样本中存在的不同细胞或组织类型的贡献。肿瘤主要由癌细胞、基质细胞和免疫细胞组成。使用反褶积方法，我们可以判断肿瘤中的细胞类型和比例。我们也将这种方法应用于体液，尽管成功与否取决于细胞和组织类型所特有的基因特征的质量。然而，流体中的反褶积结果已经显现出来。我们在血浆、尿液和脑脊液（CSF）中看到各种有意义的细胞类型特征，并随时间发生变化。这些RNA特征可用于证明癌症是否存在、是否已复发或正在缓解。我期望使用这些先进的分析方法会有一些重要的发现。
问：您向客户提供哪些数据？
珍:我们向客户提供的数据取决于他们需要回答的问题。通常，他们想要的是基因水平的量化数据。然而，对剪接变异、突变分析、RNA编辑和环状RNA数据的需求正在增加。客户收到原始和处理过的数据，以及结果报告。
“液检查空间和肿瘤领域外部的RNA分析存在显着增长机会。”
问：什么是RNA-Seq的的与疾病评估DNA测序数据的价值？
珍:我相信RNA-Seq数据提供了与DNA测序相同甚至更多的信息数据。除了基因表达分析，我们还可以确定拷贝数变异7 8,突变7， RNA编辑，并进行t细胞受体分析9以及免疫细胞分析。10.如果你越过蛋白质编码区域进入lncRNA，生物标志物的潜力也明显更大，与20,000个蛋白质编码基因相比，lncRNA中有50,000个潜在基因。最终，它的价值可能在于共同观察RNA和DNA特征，以评估癌症或疾病样本。
问：您如何将液体活检测试在未来发展？
珍:基于DNA分析的液检变量测试急剧增长肿瘤学应用。我刚刚在2019年精密液体活检会议上发表讲话，希望我成功地沟通RNA分析的价值进行液体活检。单独的DNA不够动态或响应。最多，CTDNA说了一些关于癌细胞和存在的突变的东西。它毫无疑问，宿主如何应对肿瘤或免疫系统或基质细胞如何与其相互作用。我们可以看到具有RNA分析的这些信号，包括囊泡和血小板发生的内容。有一个专注于肿瘤受教育的血小板的新场，正在围绕使用纯化的囊泡来制定新的治疗方法，用于治疗癌症或心脏病等各种类型的人类疾病。液体活检空间中RNA分析和肿瘤领域的外部存在显着增长机会。
问：Biogazole的下一步发展是什么？
珍:我们要长大的Biogazelle客户群超越欧洲，并继续提供独特的服务。我们不仅仅是一个RNA-Seq的服务提供商。我们设计的实验，并进行了广泛的生物信息学分析是为客户提供对数据的洞察力和支持发展中有价值的诊断和治疗他们的下一个步骤。亚博下载app我们只需要宣传。
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新闻文章:
参考
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