次世代シーケンスの主なステップ
次世代シーケンスのワークフローは3.つの基本的なステップ（ライブラリー調製、シーケンス、データ解析）で構成されます。各ステップの基礎を学び、NGSワークフローの計画をどのように立てるかをご確認ください。
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NGSワークフローの準備
次世代シーケンスワークフローを始める前に、核酸を分離して精製します。一部の脱氧核糖核酸抽出法では阻害剤を加えることがありますが、阻害剤はNGSワークフローで行う酵素反応に悪影響を及ぼす場合があります。最良の結果を得るためには、サンプルの種類に最適な抽出プロトコールを使用してください。核糖核酸シーケンス実験の場合は、逆転写によって核糖核酸をcDNAに変換します。
ほとんどのNGSワークフローでは、抽出後に质量控制ステップが必要となります。純度評価には紫外线分光光度法を、核酸の定量には蛍光測定法を用いることをお勧めします。
NGSワークフローのステップ1：ライブラリー調製
ライブラリー調製は、NGSワークフローを成功させるために極めて重要です。このステップでは、脱氧核糖核酸または核糖核酸サンプルをシーケンサーに対応できるように調製します。基本的には、脱氧核糖核酸を断片化し、その両端に特異的なアダプターを付加してシーケンスライブラリーを作成します。イルミナのシーケンスワークフローでは、これらのアダプターは、脱氧核糖核酸断片をフローセルに結合できるようにする相補配列を含みます。次に、これらの断片を増幅して精製します。
リソースを節約するために多数のライブラリーを1.つにまとめて複合ライブラリーとし、1.回のランでシーケンスすることもできます。このプロセスはマルチプレックスとも呼ばれます。アダプターライゲーション時に、固有のインデックス配列である「バーコード」を各ライブラリーに加えます。データ解析時に、これらのバーコードを使用して各ライブラリーを識別します。
ライブラリー調製の資料
NGSワークフローのステップ2：シーケンス
NGSワークフローのシーケンスステップ時に、ライブラリーをフローセルにロードしてシーケンサーにかけます。クラスター形成と呼ばれるプロセスで脱氧核糖核酸断片のクラスターが増幅され、一本鎖脱氧核糖核酸の何百万ものコピーが得られます。イルミナの大部分のシーケンサーでは、自動的にクラスター形成が行われます。
合成测序（SBS）と呼ばれるプロセスでは、化学修飾ヌクレオチドが相補的に脱氧核糖核酸テンプレート鎖に結合します。各ヌクレオチドには蛍光タグと次の塩基への結合をブロックする可逆的ターミネーターが含まれています。蛍光シグナルによってどのヌクレオチドが付加されているかが示されます。次にターミネーターが切断されて次の塩基が結合できるようになります。
脱氧核糖核酸の順鎖を読んだ後そのリードは洗い流され、逆鎖に対しこのプロセスが再度行われます。この方法をペアエンドシーケンス法と呼びます。
NGSワークフローのステップ三：データ解析
シーケンス後に装置に搭載されたソフトウェアがヌクレオチドを識別し（ベースコールと呼ばれるプロセス）、そのベースコールの予測精度を特定します。データ解析時に、シーケンスデータを標準解析ツールにインポートしたり、ご自身のパイプラインを設定したりすることができます。
現在では、バイオインフォマティクスのトレーニングを受けたり、ラボスタッフを追加したりせずに、直感的に操作できるデータ解析アプリを使用してNGSデータを解析できます。これらのツールには、シーケンスアライメント、バリアントコール、データの可視化、または解釈機能が備わっています。
注目のNGSワークフロー
微生物の全ゲノムシーケンス
微生物の全ゲノムシーケンスを使用すれば、病原体の特定、ゲノムの比較、抗菌薬耐性の解析が可能になります。イルミナのNGSワークフローでは、このアプリケーションの各ステップに適した推奨方法と製品について説明します。
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