利用基因发现和细胞模型来理解神经发育障碍的遗传学基础

介绍

居住在澳大利亚的拉克兰·乔利博士充分利用了户外活动的一切便利。乔利博士不骑车、冲浪、徒步旅行或打篮球的时候，就会参与同样广泛的研究项目，以确定和研究导致神经紊乱的基因。为了发现新的基因变异并描述它们在智力残疾中的作用，Jolly博士将细胞模型与多种遗传和功能基因组技术相结合。

作为阿德莱德大学的澳大利亚研究理事会，Jolly博士在神经发生的研究计划中具有主导作用。虽然其他群体识别神经发育障碍潜在的基因变异，博士博士指导研究以发现遗传变化的影响。“我们想知道功能效果基因变异在大脑的发展中，”霍比斯博士说。“我们知道他们造成人类障碍，但我们想知道它们如何影响细胞行为和沟通方式。”本集团使用下一代测序（NGS）来识别新型突变，以及胚胎神经发展的细胞培养模型，深入了解脑发育和功能重要的新遗传网络。他最近的一些工作导致了两个基因的发现（UPF3B和HCFC1)在智力残疾中起着重要作用。在繁忙的工作间隙，乔利博士向iccommunity介绍了他的基因发现研究。

问:是什么激发了你的研究，导致你确定了UPF3B和HCFC1基因变异?

拉克兰快活(LJ):2009年，我们为2009多个具有智力残疾家庭的公布研究贡献，这些智力受到影响的雄性成员，表明X染色体可能涉及。我们在该队列的X染色体上对整个编码区进行了exome测序，以发现致病基因变体。这种大型基因组研究涉及许多我现在学习的基因，包括UPF3B和HCFC1．

我们在队列中找到了几个家庭，它具有完全丧失的功能突变UPF3B．根据遗传学，我们马上就知道了UPF3B批判性地参与了大脑发展。我们直接解读该基因的突变如何导致受影响的个体中看到的异常脑发展。^1那2

这HCFC1当我们认识到，在群组中有许多受影响的男性的群体中有一个大型多铸造家庭进行了研究。我们肯定X染色体参与，但我们无法在可以解释表型的编码区内找到任何致病变种。与其他基因组学测定的更广泛的搜索，建议参与非编码变体HCFC1基因。^3.

问：我们可以从使用不同类型的细yobet亚洲胞系来了解脑发展的内容如何？

LJ：我们经常用在体外细胞系因为它们允许我们快速筛选变体，并确定是否有保证更复杂的模型。和在体外细胞系，我们可以轻松访问材料，并在遗传上操纵它以适应我们的模型并获得快速读数。

我们发现离体从发育中的大脑或胚胎干细胞中提取的培养物具有分化为脑细胞的潜力，可以作为大脑发育的替代品。相对于静态细胞模型没有或有限的分化潜力或模拟大脑发育方面，我们选择细胞培养模型，概述大脑发育的事件。这给了我们所见之间的关联在体外在开发期间患者的大脑可能发生了什么。通过这些信息，我们可以继续前进到更复杂的动物模型，我们可以研究行为和生理系统，脑网络。

“我们发现从未与遗传疾病相关的基因，特别是神经发育脑疾病。”

LJ：UPF3B已知参与废话介导的mRNA衰变（NMD）途径。最初发现NMD作为mRNA监测机制，其中它识别并降解了早期终止密码子的转录物。因此，它涉及所有遗传疾病的近三分之一，是由过早终止密码子引起的相同数量的遗传障碍。然而，NMD途径现在也被认为是主要的基因调节途径，许多内源mRNA转录物遍布通过NMD调节的特征。敲出核心NMD组件，UPF1或者UPF2，导致5-10%的正常转录组失调。这些转录本对发育很重要，因为在小鼠、斑马鱼和苍蝇模型中观察到胚胎致死表型。相比之下,UPF3B人类的突变不是致命的，反而会导致智力残疾。鉴于其在NMD中的作用，我们假设NMD通路可能在受影响的个体中受到损害，并且他们的转录组可能被改变。

问：什么是什么影响UPF3B脑发展与智力残疾的突变？

LJ：智力残疾由此产生的UPF3B突变范围从轻度到严重，并且可以包括诸如自闭症，注意力缺陷多动障碍（ADHD）和精神分裂症等额外行为问题。我们已经确定了我们研究过的受影响人物的表型谱。即使在一个具有相同的两个兄弟的单个家庭内，也存在表型变异性UPF3B突变，一个兄弟有严重的智力障碍，而另一个只有轻微的影响。

我们发现了一种可能改变UPF3B突变导致疾病的结果。这UPF3B基因有一个副病虫病，UPF3A．缺少UPF3B函数,UPF3A部分功能是否冗余，介入并取代UPF3B．我们发现在受温和地受影响的兄弟中，UPF3A与他严重影响的兄弟姐妹相比，表达升高，我们在其他人中看到的趋势UPF3B突变。我们现在正在系统时尚测试UPF3A功能可能是疾病结局的一个调节剂。通过我们的研究，我们有证据表明UPF3B在某种程度上改变了转录组，导致了发育中的大脑原始细胞行为的改变。我们正在测试是否UPF3A功能可能会拯救这些缺陷。

“Illumina技术对于我们理解未诊断的神经发育障碍背后的遗传学至关重要。”

问:是什么让你在非编码区域寻找HCFC1还是

LJ：我们评估了来自一个多代大家庭的样本，其中有许多受影响的男性个体，筛查X染色体上的每个编码区域，以发现变异。然而，我们没有发现任何编码变体。

然后，我们进行了联系分析，以鉴定染色体的部分，这些染色体在受影响的个体中共用，而不是在不受影响的男性中共用。使我们能够专注于仅包含108个基因的X染色体的小区域。我们在使用Illumina基因组分析仪系统中围绕这些基因进行的所有编码和调节序列测序，获得极高的覆盖率，每个碱基对平均超过100个读数。当我们再次发现该地区没有变体时，我们在编码区域外面看。我们发现了一种有趣的非编码变体，受到在非基因区域中受到高度保守的转录因子结合位点。非致突变导致损失称为YY1的转录因子的结合，这通常是抑制的HCFC1表达。

问:你是如何发现这个角色的HCFC1在正常的大脑发育中?

LJ：作为HCFC1本身就是一项转录的核心，我们看着看看是否在患者中，我们可以识别可能进一步涉及其参与的转录组变化。我们使用患者衍生的血细胞系，称为淋巴细胞细胞系，研究HCFC1．虽然这些细胞系来自血液，但它们的转录特征与神经元和大脑支持细胞重叠，使它们能够作为大脑内部可能发生的事情的代理。利用淋巴母细胞系，我们发现HCFC1是过度表达的，这与大约200个其他基因的放松管制有关。通过基因本体论分析进一步支持了基因的参与HCFC1，识别过程HCFC1如线粒体和染色质调控。更重要的是，基因本体分析相关联HCFC1与神经元的发育和分化有关。从那里，我们决定模型的效果HCFC1研究过度表达在大脑发育中的作用。

问:你是如何做模特的HCFC1还是

LJ：基因本体论途径表明HCFC1与前脑发育有关。我们从胚胎小鼠前脑中分离并培养了神经元和神经干细胞在体外．这给了我们一个机会去操纵它们并尝试创造一个疾病模型。我们中HCFC1，并监测这如何影响神经细胞的行为。HCFC1对正常的细胞行为有强大的影响。神经元轴突和树突生长减少，而神经干细胞的过表达诱导它们退出细胞周期并分化为星形胶质细胞。这为非编码突变的上游HCFC1导致其过度表达可能会对人性大学发展的方式产生影响体内．

“我们的功能研究有助于指出大脑发育中哪些细胞类型或方面受到了影响，并可能导致发现新的治疗靶点和机制。”

问：过度表达如何HCFC1导致智力残疾?

LJ：目前很难回答这个问题。我们没有足够的信息将我们所看到的联系起来在体外我们可以从大脑的结构中得出的东西。患者没有详细的MRI分析来看看他们的大脑结构。我可以假设当您在神经干细胞的过程中具有改变时，如果您离开细胞周期，或者如果神经干细胞具有额外的增殖能力，则表型相关性是微微症。可能是我们没有意识到的大脑的畸形部分，这将是我们所看到的一致在体外．其他影响更微妙的因素可能也起了作用，比如神经元连接或通讯的缺陷。需要更复杂的模型，如转基因小鼠，以更好地理解HCFC1在脑病中。

问：您如何确定在研究中使用哪种技术？

LJ：如果我们发现了一个我们认为与之相关的基因，我们就会根据这个基因的已知信息来判断。UPF3B和HCFC1是调节基因表达的两个基因。UPF3B是mRNA衰变机制的一部分吗HCFC1是一种转录辅助调节因子。知道转录组可能受到影响，我们使用RNA-Seq分析这些特定的突变对患者来源的细胞系的转录组有多大的影响。如果这些信息暗示了大脑发育的任何方面，我们可以用在体外神经细胞模型系统。在这两个基因的情况下，这种方法非常成功。

问:Illumina测序系统和阵列如何使您的研究成为可能?

LJ：我们在HiSeq 2500系统上进行外显子组测序以发现基因。我们使用HiSeq X Ten系统进行全基因组测序，我们使用Illumina阵列进行连锁和位点定位。Illumina技术对于我们理解未诊断的神经发育障碍背后的遗传学是绝对关键的。它们使我们能够发现新的基因，然后我们可以通过在基于细胞的模型中进行功能研究来进一步分析这些基因。

为了HCFC1项目，我们在Hiseq 2500系统上进行了RNA-SEQ的转录组分析，并使用HumanHt-12 V4表达珠芯片。我们选择了这个阵列，因为它具有QPCR和RNA-SEQ数据的良好协调。

为了UPF3B项目，我们使用RNA-SEQ和Humanomni Beadchips分析患者细胞系中的拷贝数变体。学习拷贝数变体很重要，因为每个人都有自己的个人基因组变化。基因表达变化是否可以与副本数量的增益或损失相关，是我们对学习的损失。具体而言，我们想了解转录组的变化是否有UPF3B突变是由于NMD缺陷，或由于个人拷贝数变体。

“将有许多变体最终有一个问题标记。将需要在更多的基于研究的环境中使用NG来帮助分配功能。“

问：你的发现怎么样UPF3B和HCFC1改善人类健康?

LJ：我们正在发现从未与遗传疾病相关的基因，特别是神经发育脑疾病。当我们发布我们在各种公共数据库中发现的表型和基因型时，这有助于我们对影响研究努力和临床诊断的智力残疾潜在原因的集体理解。我们希望通过进一步突出这些案例，它将导致对受这些基因变化影响的其他人的诊断测试和解决方案。

在为新疗法的发展做出贡献方面，我们进一步走了。我们的功能研究有助于表明大脑发展的细胞类型或方面受到影响，并且可能导致对新的治疗目标和制度的发现。例如，我们正在进行审讯UPF3A以及它在改变结果中的潜在作用UPF3B突变。然而，对治疗策略的发展和科学检测是一个经常需要多年或数十年的过程。我们只是在研究这些新发现的基因的过程开始。

问：你如何看待未来对您的研究影响的NG？

LJ：NGS已从主要的基于研究的工具中出现在临床诊断中的一种普遍存在的方法。亚博下载app因此，正在识别许多新的遗传变体，但这是一种将功能分配给未知意义的变体的安装挑战。我们可以将大数据集和群组组合在一起，这提供了一些分配意义的效用，例如如何罕见，或者在类似表型的患者中之前发现。但是，会有许多变体最终有一个问题标记。在更多的基于研究的环境中，使用NGS的使用来帮助分配功能，正如我们在研究中所做的那样。例如，我们的转录组询问UPF3B和HCFC1患者细胞系，NGS非常适合，提供了他们的参与的证据，并引导我们的基于神经细胞的研究，以帮助识别发育，细胞和分子机制。NGS技术无疑将发挥重要作用，支持有争议的高吞吐量需求，和/或对样品的高度深度分析，以应对临床诊断和更具研究的努力问题。

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