英国实验室使用SNP阵列加速和增强细胞遗传学分析

介绍

在英国纽卡斯尔泰恩医院的北方遗传学服务中心工作了近三十年，^1.临床细胞遗传学家Simon Andrew Zwoliński博士使用了广泛的细胞遗传学技术。他主要使用出生后的样本，对他的方法的及时性和准确性非常敏感

Zwoliński博士一直对他在工作中使用的方法和技术的发展持开放态度。他的职业生涯始于g波段和荧光原位杂交（FISH），转移到细菌人工染色体（BAC）比较基因组杂交（CGH）阵列，然后是寡核苷酸阵列。2015年，他开始对基于SNP的阵列感兴趣。在比较Illumina CytoSNP-850K珠芯片与安捷伦CGH+SNP和Affymetrix CytoScan SNP阵列后，他选择了Infinium CytoSNP-850K珠芯片。他的团队在NextSeq上验证了阵列®并在一个月内顺利过渡到使用CytoSNP-850K BeadChip。

我社区与Zwoliński博士讨论了CytoSNP-850K BeadChip的有益品质以及它如何提高了他的团队的效率。

西蒙·安德鲁Zwoliński博士是英国纽卡斯尔泰恩医院北方遗传学服务中心的产后细胞遗传学和阵列主任。

问:是什么激发了你对遗传学的兴趣?

西蒙·安德鲁Zwoliński (SAZ):我最初被训练成植物学家，专门研究植物育种和作物进化。然后我在伯明翰攻读了应用遗传学硕士学位，在伦敦帝国理工学院获得了纯遗传学博士学位。我对预测减数分裂分离模式的能力很着迷Ascobolus浸泡.

问:在你的职业生涯中，经历了所有技术的变化是什么感觉?

萨兹：当我开始我的职业生涯时，全是孟德尔遗传学。然后人们开始识别DNA序列，不久之后整个人类基因组都被测序了。这对诊断遗传学有着深远的影响。进行细胞遗传学就像“发现差异”，在光学显微镜下寻找微小的变化。如今，细胞遗传学是基于计算机的，我们正在解释拷贝数变化的实际基因内容。如今，大多数临床科学家甚至都不考虑孟德尔遗传学，对此我感到有点难过。

问:下一代测序(NGS)等新技术如何帮助识别与以前未知的遗传综合征相关的变异?

萨兹：NGS已经识别了致病基因和相关表型，所以现在我们可以在阵列解释中使用这些信息。

问:在过去几年里，这些发现的速度增加了吗?

萨兹：发现的速度是指数增长的。有大约20个综合症，我们可以识别我们在2006年首次开始表演阵列时。我们现在前往500个我们可以识别阵列的综合征，其中一些仍然没有命名。

问：你今天在实验室做了哪些类型的细胞遗传学检测？

萨兹：目前，我们仍在进行g显带，以寻找平衡的重排，并使用FISH和一些类型的细胞遗传学检测染色技术。然而，我们现在的大部分工作都是关于SNP数组。

问：您使用的每种不同的细胞遗传学检测技术有哪些优点和缺点？

萨兹：当我在1988年开始工作的时候，我们只有g波段和一种叫做c波段的方法。这是一种全基因组筛查，但它获取的信息令人恶心。我们看到的是一个分辨率约为5兆兆位。我们的异常识别率低于5%。当我们进展到FISH时，我们仅限于知道样本是否代表一种特定的综合征。FISH只会给出一个“是”或“不是”的答案。

然后我们与许多其他技术合作，这些技术来得快去得也快。一个叫M-FISH，它给每条染色体赋予不同的颜色，这样我们就可以看到g带所看不到的易位。我们还尝试了多重连接依赖探针扩增(MLPA)用于端粒重排。

我们在2006年开始使用BAC阵列，并在2010年转向寡聚阵列。2016年，我们转向了SNP阵列，这是迄今为止最强大、最准确的检测异常的阵列。根据我们的经验，我们发现我们有1 / 20的机会发现异常使用g带。随着新技术的引进，我们发现异常的机会增加了。利用CytoSNP-850K序列，我们现在可以在4个样本中找到1个答案。这是一个很大的不同。

问:SNP阵列能提供寡聚CGH阵列不能提供的什么?

萨兹：Oligo阵列和BAC阵列只能识别拷贝数发生变化，而SNP阵列可以识别复制中性变化，例如发单调性强性（UPD），杂合性丧失，缺乏杂合性。SNP阵列是强大的工具，不需要额外的工作来获得附加信息。

“CytoSNP-850K阵列非常好，看起来非常可靠和一致，我们只用了四周就完成了过渡。”

问:你考虑过什么SNP阵列?

萨兹：我们调查了所有商业SNP阵列供应商，包括安捷伦、Affymetrix和Illumina。我们选择了CytoSNP-850K BeadChip，因为我们认为它在分辨率、设计和成本方面都是最好的平台。从我们过去的经验中，我们也知道Illumina是可靠的，我们与该公司保持着良好的关系。

我们做出决定的另一个因素是BlueFuse®我们已经熟悉了用于分析SNP阵列的Multi Software。这是一个重要的卖点，因为软件质量高，用户友好。

问:你们是如何过渡到CytoSNP-850K珠晶片的?

萨兹：当我们决定改用CytoSNP-850K BeadChip时，我们召开了大约三个月的会议，以说服我们研究所的管理人员，从寡头到单核苷酸多态阵列的转变是一个好决定。

我估计，验证阵列平台大约需要8周时间，同时运行oligo和SNP阵列还需要4周时间。我认为这将是过渡和训练我们团队所需的时间长度。然而，CytoSNP-850K阵列的表现如此可靠和一致，我们仅在四周内完成了转换。2016年2月，我们使用了寡核苷酸阵列，到2016年3月初，我们只使用了单核苷酸多态性阵列。

“我们现在发现了寡核苷酸阵列无法识别的SNP异常。”

问:你们是如何验证CytoSNP-850K珠晶片的?

萨兹：为了验证CytoSNP-850K阵列，我们运行了32个历史异常样本。在每一种情况下，SNP阵列不仅能检测到异常，而且在确定断点方面比寡核苷酸阵列要精确得多。异常的大小都在我们从寡聚阵列估计的最小值和最大值之间。这些数据验证了SNP阵列，并向我们展示了oligo阵列在给出大小范围方面最初是多么的好。

当我们选择这32个原始样本时，我们确保它们代表了一系列的遗传异常，包括缺失、重复和三次重复。我们还选择了无染色体，三染色体，非常小的异常，以及已知的男性和女性性染色体异常的样本。偶尔，即使在32个样本中，我们也会发现比我们从寡聚阵列中获得的信息更多。一些拷贝数变化在寡聚体阵列上看起来很简单，但在CytoSNP-850K阵列上却很复杂。

问:你们在CytoSNP-850K BeadChip验证研究中使用了哪些组织类型?

萨兹：我们主要使用血液，也对恶性肿瘤样本进行验证。特别是，我们观察了使用这两种技术的致癌基因扩增是什么样的。此外，我们分析了一些胎盘样本，其中我们知道有母细胞污染，这很容易被CytoSNP-850K BeadChip检测到。我们还分析了一些产前样本，以确保这项技术适用于我们常规使用的所有组织类型。

问:验证研究花了多长时间?

由于CytoSNP-850K BeadChip非常好，能够精确地识别遗传异常，我们只花了三周的时间验证该阵列。寡聚体和SNP阵列并行运行了几周，但是我们几乎没有观察寡聚体，因为我们对CytoSNP-850K BeadChip数据非常有信心。

我们保存了一些寡核苷酸玻片和一些试剂以备不时之需。最后，我们意识到我们不会再使用它们了，所以我们把它们提供给了另一个仍然在做寡子阵列的实验室。目前，我们不打算重新使用寡聚阵列。

问：培训花了多长时间使您的团队熟悉运行NextSeq 550系统和CytoSNP-850K BeadChip？

萨兹：Illumina的工作人员非常棒，他们用了两周的时间来训练我们进行实际的设置和分析。值得注意的是，我们的团队很快就掌握了工作流。我们没有遇到任何问题，并且在过去的几个月里训练了整个团队。

成功过渡到CytoSNP-850K BeadChip的一个显著好处是减少了所需的实际操作时间。我们每周用CytoSNP-850K芯片分析64-128个样本。如果我们试图用寡头阵列进行那么多分析，我们根本就没有人力。即使每周只有64个样本，也至少需要三个人来使用寡头阵列进行分析。

“Illumina的工作人员非常奇妙，在为期两周的时间内训练我们，以执行实际设置和分析。我们的团队抓到工作流程的速度是显着的。”

问：Cytosnp-850k珠芯片结果如何与ACGH结果相比，在分辨率方面进行比较？

萨兹：两种技术之间的差异很重要。由于国际细胞因子中的国际标准（ISCA）v2 oligo阵列设计，许多综合征没有很好地覆盖。关于SNP阵列的一个积极事物是，它们被设计成包括所有已知的综合征，并且每个靶向基因被覆盖。我们现在正在拿起我们无法识别的SNP异常。

问:寡核苷酸阵列和SNP阵列对DNA浓度的要求有区别吗?

萨兹：这是有区别的，但它并没有对我们产生影响。我们过去花了大量时间清理寡聚物阵列的DNA，我们不再需要这样做了。我们正在用CytoSNP-850K珠芯片处理样本，就像它们从机器人上下来一样，这节省了大量的工作和时间。因此，我们的周转时间有所改善。

问：你能用CytoSNP-850K珠芯片检测到杂合性缺失吗？

萨兹：CytoSNP-850K BeadChip为我们提供了更准确的测定拷贝数变化和拷贝中性变化的方法。掌握等位基因频率和有关杂合度的深入信息是很有用的。SNP数组提供内置的确认，当我们有一个删除或重复，我们可以看到的对数R比率。当我们用寡聚阵列分析样本时，我们意识到大多数由软件发出的调用都不是真实的。我们不得不根据我们在受试者队列中看到这个呼叫的次数来猜测它们不是真实的。当我们今天进行SNP测序时，我们可以通过B等位基因的频率来判断它是否是真的，这给了我们对结果的信心。此外，对于一些综合征区域，CytoSNP-850K BeadChip上有超过100个阵列特征，而寡核苷酸阵列上只有3或4个特征。

问:与oligo阵列相比，CytoSNP-850K BeadChip检测扩增或镶嵌是否有区别?

萨兹：当我们使用寡核苷酸阵列时，我们希望看到理论上的对数2比率，重复为+0.6，删除为-1.0。然而，这只是一个理论值，并且总是存在一定程度的变化。有时我们会得到一个log2比率，不是+0.6或-1.0，这会给我们一个关于镶嵌的线索，但我们只能通过FISH来证实这一点。现在我们可以通过B等位基因频率的偏差清楚地识别镶嵌和多拷贝。

很难知道什么程度的镶嵌可以被准确检测到，但我估计我们已经确定了低于10%的删除水平。有了这些复制品，检测镶嵌的难度要大得多，我猜我们可以看到大约20%的水平。对于多个拷贝，我们可以通过查看B等位基因频率图中的不同模式来了解有多少拷贝。

“我们每周用CytoSNP-850K BeadChip分析64-128个样本。如果我们试图用寡聚阵列进行这么多的分析，我们根本就没有人力。”

问:你对过渡到CytoSNP-850K珠晶片有什么担忧吗?

萨兹：当我们转移到CytoSNP-850K BeadChip时，我们担心的一件事是我们可能获得的呼叫数量增加。实际上，调用的数量与我们使用oligo数组获得的调用数量没有什么不同。不同之处在于，使用CytoSNP-850K BeadChip，几乎所有呼叫都是真实的。很容易判断它们是良性的还是致病性的，因为良性的通常位于没有重要基因或外显子的地方。

虽然SNP阵列可以识别某些综合征的UPD或杂合性缺失，如Prader-Willi、Russell-Silver或Beckwith-Wiedermann，但我们也发现了不显著的全染色体UPD。这需要敏感的报告，我们仍在学习过程中。我们还担心确定血缘关系，这可能只有父母中的一方知道。yobet亚洲

问：你们实验室的下一步是什么？

萨兹：我们将专注于巩固我们与CytoSNP-850K阵列的工作，并开始使用NextSeq 550系统对恶性肿瘤样本的基因面板进行测序。在未来，我们希望NGS能帮助我们检测与自闭症和癫痫相关的基因变异。

当我们转向SNP阵列时，大学里的各种研究小组都要求我们提供SNP服务来分析细胞系。在过去，他们要么没有对他们的细胞系进行阵列分析，要么把它们送到昂贵的私人服务公司。

我们预计每年进行2000例细胞遗传学分析，自从我们开始使用SNP阵列以来，在八个月内我们已经进行了2000多例。我们已经提高了吞吐量和效率，我们对此感到高兴！

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