英飞纳姆试验最佳做法
避免交叉污染
的英飞纳姆协议使用线性放大过程将输入DNA样本的量增加到最佳水平。执行预扩增过程的实验室空间，例如量化和标准化，必须与放大后实验室空间分开。扩增产物可以污染试剂，仪器和DNA样品，导致不准确和不可靠的结果。扩增产品污染可以关闭实验室过程，并显着延迟正常操作。
设置时英飞纳姆实验室:
| • | 在放大器前和放大器后区域应使用单独的设备，如实验室涂层、手套、安全眼镜、移液管、离心机、加热块和heal密封剂。 |
| • | 应设置单独的水槽，用于冲洗前置和后置的贮水池。 |
| • | 不要在前置放大器和后置放大器之间共用一个水净化系统。 |
| • | 供应英飞纳姆协议应始终存储在前置区，并根据需要转移到后置区。 |
当后一个英飞纳姆协议：
| • | 当添加或转移样品时，在每个孔之间更换针尖。 |
| • | 当从前置放大器移动到后置放大器区域时，使用单向工作流。 |
| • | 为了防止放大产品或探头的转移，在放大器后区域开始工作后，应避免返回到前置区域。 |
| • | 当加入试剂时，要改变每孔之间的提示。 |
| • | 如果手套接触到样品或探针，请更换手套。 |
| • | 在操作前和操作后彻底清洁工作表面。 |
| • | 在使用RNase / DNase抑制清洁剂的过程前后清洁工作表面和设备。 |
BeadChip处理
| • | 处理BeadChips: |
| - - - - - - | 仅在条形码处或沿边缘触摸珠子芯片。避免出现串珠区和样品入口。 |
| - - - - - - | BeadChips玻璃。使用前检查是否有破损，小心轻放。 |
| - - - - - - | 如果使用自锁镊子保持珠芯片，请小心避免刮擦珠芯片表面。 |
| • | 在清洗和涂层珠晶片之前: |
| - - - - - - | 不使用时，将洗盘盖放在洗盘上。 |
| - - - - - - | 用低压空气清洁洗涤盘以在使用前除去颗粒。 |
| - - - - - - | 管架和管盘在使用前和使用后都要彻底清洗。用去离子水冲洗2O.把它们倒放在洗衣架上晾干。 |
| - - - - - - | 准备一个额外的清洁管架，适合真空干燥器的内部尺寸。允许每8个BeadChips一个机架。 |
丢弃物品
按照这些最佳实践来处理掉在地上的物品。
| • | 掉到地板上的任何物品都受到污染。 |
| • | 戴上实验室手套，接触掉到地板上的任何物品。 |
| • | 立即用10%的漂白剂清洗非一次性物品，如移液管或重要的样品容器。 |
| • | 使用10%的漂白剂溶液清洁任何与污染物品接触的实验室表面。 |
| • | 扔掉你的实验室手套并在处理到地板的物品后戴上一双。 |
玻璃背板
在XStain过程中，玻璃背板用于流动室，以控制试剂在BeadChips上的流动。在打开包装和每次使用后清洁玻璃背板。此外，在每七次使用后进行漂白剂清洗，或更频繁，这取决于个人实验室的吞吐量。每次使用前检查玻璃背板。
每次使用后清洁
当您第一次和每次使用后打开它们时，清洁玻璃背板。清洁前拆卸玻璃背板。
| 1. | 准备1% Alconox溶液。 |
使用2.5g Alconox粉/每250ml di h2O。
| 2. | 将带有玻璃背板的塑料支架浸入装满1% Alconox的容器中。 |
| 3. | 用金水擦拭每个玻璃背板并返回机架。 |
| 4. | 从1％Alconox溶液中取出机架，并用DI H彻底冲洗玻璃背板2O。 |
| 5. | 让玻璃背板在塑料架子上晾干。 |
| 6. | 玻璃背板清洁干燥后，用70％EtOH浸泡的金奶擦拭。 |
| 7。 | 将玻璃背板存放在无尘区域的塑料架中。 |
| 8。 | 使用前用一罐压缩空气或实验室气枪清除玻璃背板上的灰尘或绒毛。 |
漂白剂清洗
在清洗过程中，要穿上实验服、护目镜和手套。
漂白剂是刺激物。搬运时要小心。
在通风橱或珠芯筒制作实验室之外的实验室空间中执行此程序。过度的漂白烟雾会降解所使用的荧光染料英飞纳姆试验．
大约每七次使用后用漂白剂清洗玻璃背板，或更频繁，这取决于个别实验室的吞吐量。玻璃背板的清洁步骤如下:
| 1. | 制作10%的漂白剂溶液。 |
示例：将100毫升漂白剂加入900毫升DI H.2彻底混合。
| 2. | 在通风柜内进行以下操作: |
| • | 在一个容器中加入10%的漂白剂，完全覆盖架子和玻璃背板。 |
| • | 将带玻璃背板的塑料支架放入容器中。 |
| • | 浸泡1小时。 |
| 3. | 将有玻璃背板的机架转移到充满DI H的容器中2O。 |
您可以将容器和机架与玻璃背板从通风罩转移到附近的水槽2O。
| 4. | 将包含玻璃背板的机架上下20次。小心不要削减玻璃背板。 |
| 5. | 取下装有玻璃背板的架子，并用脱氢酶冲洗玻璃背板2O。 |
| 6. | 处理掉DI H2O从容器中取出。冲洗并向容器注入新鲜的脱氢盐2O。 |
| 7。 | 将包含玻璃背板的机架返回到容器中。 |
| 8。 | 玻璃背板架上下浸泡20次，浸泡5分钟，注意不要使玻璃背板碎裂。 |
| 9。 | 重复步骤4-7 4次。 |
| 10 | 处理掉DI H2O。 |
| 11. | 取下装有玻璃背板的支架，并用去离子水冲洗2O。 |
| 12. | 让玻璃背板在塑料架子上晾干。 |
| 13. | 玻璃背板清洁干燥后，用70％EtOH浸泡的金奶擦拭。 |
| 14. | 将玻璃背板存放在无尘区域的塑料架中。 |
| 15. | 使用前用一罐压缩空气或实验室气枪清除玻璃背板上的灰尘或绒毛。 |
拆卸材料室
在英飞纳姆试验程序中，通过室按照Xstain步骤拆卸。XStain试剂含有多种成分(如蛋白质、酶、抗体)，最好的做法是防止残留试剂在玻璃背板上干燥。拆卸后立即将玻璃背板对角放置在浸在DI H容器中的塑料架中2O防止干燥。拆卸所有流经腔室并将其放置在浸没式机架中后，继续清洁步骤。
塑料架浸在DI H中2O
检查玻璃背板
每次使用前，请检查玻璃背板，以确保其处于可接受的状态。如果出现以下情况，请更换玻璃背板:
| • | 试剂储存区出现芯片或损坏 |
| • | 在流通腔室中面向珠子的表面的显着芯片或损坏 |
| • | 玻璃上的裂缝可能会导致玻璃在化验过程中破裂 |
| • | 无论位置如何，任何可能导致伤害的碎片或损坏 |
玻璃背板清洗、漂白和储存的推荐架
建议使用聚丙烯试管架（即塑料架）进行清洁，漂白和储存玻璃背板。将玻璃背板对角线放置在机架中以最小化玻璃之间的接触并防止损坏。
玻璃背板的正确放置
杂交腔室
| • | 堆栈中不超过三个室Illumina公司杂交炉． |
| • | 将腔室盖子和底座保持在一起。采用标签约定，将每个腔室与原始盖子对。 |
| • | 定期检查盖基对，确保它们牢固地贴合。还要检查铰链是否有异常磨损或配件松动的迹象。气密密封要求铰链有足够的夹紧强度。 |
| • | 记录每个珠芯片使用的杂交室。如果出现样品蒸发或其他处理异常，可调查适当的杂交室。 |
| • | 当杂交室镶件包含BeadChips时，在提升或移动时保持它们稳定和水平。避免摇晃，始终保持与实验台平行。 |
Infinium套件配置和批处理
Infinium套件配置为假设套件大小对应于批速尺寸，以支持各种样本尺寸。例如，某些喇叭芯片可在48样品，288样本和1152样品套件配置中提供。在使用小批量尺寸时，订购较小的48样品套件，以确保套件包含足够的试剂卷来处理较小的批量尺寸。
移液
| • | 确保移液器经过适当的校准、清洁和消毒。 |
| • | 缓慢而小心地分配，以防止在板井和流动室湍流。 |
| • | 尽可能使用多通道移液管。 |
协议的连续性
| • | 在开始该方案之前回顾一下技巧和技术，因为许多关键技术仅在这里列出，在方案中没有重复。 |
| • | 按照使用指定参数描述的顺序遵循协议。 |
| • | 除非协议中指定了安全停止点，否则立即进行下一步。 |
试剂
为获得最佳结果，应遵循以下试剂制备和存储指南:
| • | 英飞纳姆试剂盒中含有测定所需的精确数量的试剂。仔细测量试剂以避免短缺。 |
| • | 使用每批板材的新鲜试剂，以及批次之间的空储层。 |
| • | 在每个规程步骤结束后，根据设施标准丢弃未使用的试剂。 |
| • | 确保每个洗涤缓冲液的容量足够一次使用。 |
| • | 使用PB20时： |
| - - - - - - | 在室温下储存。 |
| - - - - - - | 将PB20稀释成1x PB1溶液: |
| A. | 加10升去离子水2o到20 L Carboy。 |
| b。 | 将PB20（大约1L）的整个内容物倒入Carboy中。 |
| c。 | 用di h填充20升线2O.使用刻度筒或DI H的平缓流2O以避免产生气泡。 |
| • | 当使用PB1: |
| - - - - - - | 在室温下储存。 |
| - - - - - - | 保存时间可达3个月。 |
| • | 在准备用户提供的试剂时，为了尽量减少错误，使用以下指南制备大量0.1 N NaOH和95%甲酰胺/1 mM EDTA。 |
| • | 0.1 N氢氧化钠： |
| - - - - - - | 准备新鲜的0.1 N NaOH。 |
| - - - - - - | 在打开试管的当天使用0.1 N NaOH，并丢弃所有未使用的量。 |
| - - - - - - | 避免将0.1 N NaOH暴露在露天。随着时间的推移，露天暴露会形成碳酸氢钠，这可能导致DNA变性过程的部分或完全失败。 |
| - - - - - - | 在使用之前，确认pH值≥13。 |
| - - - - - - | 0.1 N NaOH必须在一小时内用完，配制到槽中。建议配制后立即使用NaOH。 |
| • | 95％甲酰胺/ 1 mm EDTA |
| - - - - - - | 在大批中制备95％甲酰胺/ 1mM EDTA混合物。将批次分成15ml或50ml密封管。 |
| - - - - - - | 将密封管在-25°C至-15℃下储存长达6个月，并根据需要使用储存的混合物。使用您打开管的同一天使用混合物，并丢弃任何未使用的金额。 |
| • | RA1 |
| - - - - - - | 使用新鲜RA1在需要的每个步骤中。RA1已正确储存且未分配用于XStain或再悬浮步骤的物质视为新鲜物质RA1．后RA1长期暴露于室温空气中，空气不再新鲜。 |
| - - - - - - | 充分利用RA1，只倒当前步骤所需的量。如果您计划执行额外的分析步骤需要RA1同一天，将剩余的解冻试剂放在室温下的原始封闭瓶中，直到需要。遵循标准RA1本指南中描述的第二天处理和延长储存条件的储存程序。 |
| • | XC4 |
| - - - - - - | 存储未稀释的XC4和XC4在室温下用乙醇稀释。 |
| - - - - - - | 的XC4试剂瓶显示未稀释试剂的有效期。illumina支持其产品在保质期内。 |
| - - - - - - | 稀释XC4可以在为期两周的时间内重新使用，最多可将六次重复使用，最多48个珠子。 |
| - - - - - - | 显然标志着XC4瓶后已加入乙醇，以避免混淆未稀释XC4瓶子。 |
封板
| • | 在协议的以下步骤之前，一定要密封车牌: |
| - - - - - - | 颤抖的步骤 |
| - - - - - - | 涡流的步骤 |
| - - - - - - | 离心机的步骤 |
| - - - - - - | 热循环步骤 |
| • | 用胶辊或刮板器将胶封覆盖在板上，并彻底密封。 |
| • | 每次盖盘子时都要用新的封条。 |
| • | 使用微密封'B'粘合剂密封震动，离心和长期存储。该密封在-40°C至110°C有效，适用于裙边或半裙边PCR板。 |
| • | 如果你观察到液滴从一个密封板的内部悬挂，在280 x g离心1分钟。 |
| • | 定位密封垫，使盖子上的A1与盘子上的A1相匹配。 |
| - - - - - - | 确保所有96个盖帽都牢固地坐在井中，以防止蒸发和溢出，这引入了可变性和交叉污染。 |
| - - - - - - | 缓慢小心地拆除密封垫，防止飞溅，然后倒置放置在一个安全的位置。 |
| - - - - - - | 将密封垫放回板上时，确保方向正确。 |
| • | 使用热封器时： |
| - - - - - - | 如果您使用的是可编程热封器，请将其设置为165°C和5秒钟。在封口机达到所需温度后，牢固地压下并均匀压制2.5秒。之后立即使用辊以确保有效的密封。 |
| - - - - - - | 如果您使用手动热封口机，在使用前将温度设置为165°C至少20分钟。当密封剂达到所需的温度后，用力均匀地按住5秒钟。之后立即使用辊以确保有效的密封。 |
