08/24/18
使用定制测序引物制备的文库需要经过优化才能在Illumina测序平台上成功运行。将自定义引物与Illumina引物结合(或“spiking”)是必要的，当包括PhiX或其他标准Illumina库与自定义样本。Illumina无法保证定制引物的性能或兼容性，需要客户在特定平台上验证引物进行测序。当使用定制测序引物时，了解推荐的平台依赖的加载浓度、总体积、加载位置和引物退火温度。本公告提供了用于将自定义引物掺入Illumina引物的信息。
将定制引物插入Illumina引物中
*使用(C1)(V1) = (C2)(V2)方程来计算要将多少自定义引物插入井中:
C1 =定制引物的浓度（使用高浓度引物库存时，例如100um，最终体积的小额额外体积可忽略不计）。
V1 =求解要加入的自定义底漆的体积
C2 =下表中推荐的自定义引物最终浓度
V2 =下图中的Illumina引物的总量
例如:(100uM * V1) = (0.5uM * 680uL)
V1 =3.4μL
重要提示：下面的指导方针基于当前的引物体积。为了确保准确性，在进行设置之前，用移液管测量盒中的总底漆体积。
ISEQ100.
由于iseq100墨盒的构造，无法加载和使用自定义引物。
MiniSeq.
由于MiniSeq独特的双标引工作流，定制引物和Illumina引物的组合受到限制。请注意所概述的自定义primer依赖项这里。
| 套件版本 | Illumina公司底漆(名字) | 墨盒 位置 |
总计 卷(µL) |
自定义底漆决赛 浓度(µM) |
|---|---|---|---|---|
| 高输出 75个循环 |
读1 (BP10) | 24. | 550 | 0.3 |
| 阅读2 (BP11) | 25. | 610. | 0.3 | |
| 索引1 (i7)和索引2 (i5) (BP14) | 28. | 820. | 0.3 | |
| 高输出 150个循环 |
读1 (BP10) | 24. | 550 | 0.3 |
| 阅读2 (BP11) | 25. | 610. | 0.3 | |
| 索引1 (i7)和索引2 (i5) (BP14) | 28. | 857. | 0.3 | |
| 高输出 300个周期 |
读1 (BP10) | 24. | 550 | 0.3 |
| 阅读2 (BP11) | 25. | 610. | 0.3 | |
| 索引1 (i7)和索引2 (i5) (BP14) | 28. | 820. | 0.3 | |
| 中产量 300个周期 |
读1 (BP10) | 24. | 550 | 0.3 |
| 阅读2 (BP11) | 25. | 610. | 0.3 | |
| 索引1 (i7)和索引2 (i5) (BP14) | 28. | 820. | 0.3 |
nextseq 500/550.
由于NextSeq 500/550上独特的双索引工作流程，定制引物和Illumina引物的组合有限。请注意所概述的自定义primer依赖项这里。
| 套件版本 | Illumina公司底漆(名字) | 墨盒 位置 |
总计 体积（ml） |
自定义底漆决赛 浓度(µM) |
|---|---|---|---|---|
| 高输出 75个循环 v2和v2.5 |
读1 (BP10) | 20. | 1.72 | 0.3 |
| 阅读2 (BP11) | 21. | 1.98 | 0.3 | |
| 索引1 (i7)和索引2 (i5) (BP14) | 22. | 2.83 | 0.3 | |
| 高输出 150个循环 v2和v2.5 |
读1 (BP10) | 20. | 1.73 | 0.3 |
| 阅读2 (BP11) | 21. | 1.98 | 0.3 | |
| 索引1 (i7)和索引2 (i5) (BP14) | 22. | 2.83 | 0.3 | |
| 高输出 300个周期 v2和v2.5 |
读1 (BP10) | 20. | 1.73 | 0.3 |
| 阅读2 (BP11) | 21. | 1.98 | 0.3 | |
| 索引1 (i7)和索引2 (i5) (BP14) | 22. | 2.83 | 0.3 | |
| 中产量 150个循环 v2和v2.5 |
读1 (BP10) | 20. | 1.34 | 0.3 |
| 阅读2 (BP11) | 21. | 1.51 | 0.3 | |
| 索引1 (i7)和索引2 (i5) (BP14) | 22. | 2.09 | 0.3 | |
| 中产量 300个周期 v2和v2.5 |
读1 (BP10) | 20. | 1.33 | 0.3 |
| 阅读2 (BP11) | 21. | 1.52 | 0.3 | |
| 索引1 (i7)和索引2 (i5) (BP14) | 22. | 2.09 | 0.3 |
MiSeq
| 套件版本 | Illumina公司底漆(名字) | 墨盒 位置 |
总计 卷(µL) |
自定义底漆决赛 浓度(µM) |
|---|---|---|---|---|
| v2和v3 | 阅读1（HP10） | 12. | 680. | 0.5 |
| 索引1（i7）（HP12）* | 13. | 680. | 0.5 | |
| 阅读2 (HP11) | 14. | 680. | 0.5 |
*没有自定义Index 2 (i5)引物的选项，因为模板使用了在流动细胞表面嫁接的P5引物
HiSeq 1000/2000 - 1500/2500
| 套件版本 | Illumina公司底漆(名字) | 位置 | 总计 体积（ml） |
自定义底漆决赛 浓度(µM) |
|---|---|---|---|---|
| 高输出v4 | 阅读1（HP10） | CBOT板 - 第2行 | 每管0.3 | 0.5 |
| 索引1（i7）（HP12） | PE机架- 17 | 2.5 | 0.5 | |
| 索引2 (i5) (HP9) 在单个读取运行* |
PE机架- 16 | 2.5 | 0.5 | |
| 阅读2 (HP11) | PE机架- 16 | 2.5 | 0.5 | |
| 高输出v3 | 读1 (HP6) | CBOT板 - 排11 | 每管0.3 | 0.5 |
| 索引1 (i7) (HP8或HP12) | PE机架- 17 | 3.15 | 0.5 | |
| 索引2 (i5) (HP9) 在单个读取运行* |
PE机架- 16 | 3.15 | 0.5 | |
| 阅读2（HP7或HP11） | PE机架- 16 | 3.15 | 0.5 | |
| 快速运行v2 | 阅读1（HP10） | PE机架- 18 | 1.93 | 0.5 |
| 索引1（i7）（HP12） | PE机架- 17 | 1.93 | 0.5 | |
| 索引2 (i5) (HP9) 在单个读取运行* |
PE机架- 16 | 1.93 | 0.5 | |
| 阅读2 (HP11) | PE机架- 16 | 1.93 | 0.5 |
*没有自定义Index 2 (i5)引物的选项，因为模板使用了在流动细胞表面嫁接的P5引物
Hiseq 3000/4000
| 套件版本 | Illumina公司底漆(名字) | 位置 | 总计 卷(µL) |
自定义底漆决赛 浓度(µM) |
|---|---|---|---|---|
| 高输出 | 阅读1（HP10） | CBOT板 - 排11 | 0.39管 | 0.5 |
| 索引1（i7）和索引2（i5） （HP14） |
PE机架- 17 | 4.31 | 0.5 | |
| 阅读2 (HP11) | PE机架- 16 | 2.64 | 0.5 |
Novaseq.
由于NovaSeq的引物设计和双标引工作流，定制引物和Illumina引物的组合受到限制。请注意所概述的自定义primer依赖项这里。
| 套件版本 | Illumina公司底漆(名字) | 墨盒 位置 |
总计 体积（ml） |
自定义底漆决赛 浓度(µM) |
|---|---|---|---|---|
| S1 100/200/300循环 |
读1 (BP10) | 24. | 4. | 0.3 |
| 索引1（i7）（bp14）* | 23. | 5. | 0.3 | |
| 阅读2 (BP11) | 13. | 2 | 0.3 | |
| S2 100/200/300循环 |
读1 (BP10) | 24. | 4. | 0.3 |
| 索引1（i7）（bp14）* | 23. | 5. | 0.3 | |
| 阅读2 (BP11) | 13. | 2 | 0.3 | |
| S4 300个循环 |
读1 (BP10) | 24. | 7．3 | 0.3 |
| 索引1（i7）（bp14）* | 23. | 5. | 0.3 | |
| 阅读2 (BP11) | 13. | 3．5 | 0.3 |
*没有自定义Index 2 (i5)引物的选项，因为模板使用了在流动细胞表面嫁接的P5引物
使用自定义引物代替Illumina引物
如果只需要自定义引物，自定义引物可以用来代替Illumina引物。有关如何仅使用自定义引物来设置运行的说明，请参阅以下指南:
有关每个工具的索引策略的更多信息，请参阅索引测序概述指南。