实现最佳簇密度对于在MiniSeq、MiSeq、NextSeq和HiSeq 2500系统上进行高质量测序至关重要。在非模式流单元上，集群密度对运行性能有显著影响，特别是数据质量和总数据输出。下聚类虽然可以保持较高的数据质量，但会导致较低的数据输出。另外，过度聚类可能导致运行失败、运行性能差、Q30评分降低、引入排序工件和总数据输出降低。本公告总结了避免过聚类和过聚类以及实现更一致的聚类密度的资源和最佳实践。
- 图书馆的质量检查和准确量化至关重要。如果不执行，这是导致簇密度不一致的最常见原因。始终遵循中列出的方法图书馆量化和质量控制快速参考指南查看Illumina图书馆的公告
- 遵循最新的特定仪器指南，稀释和变性库:
- 库变性的最佳实践：
- 在进行任何稀释之前，2N NaOH储备溶液的pH值必须大于12.5。稀释前检查储备溶液的pH值。
- 总是准备新鲜稀释的氢氧化钠变性库在使用的时候。
- 为防止小体积移液错误影响最终NaOH浓度，应至少制备1 ml新稀释NaOH。
- 为了获得最好的结果，总是在变性和稀释文库前解冻测序试剂。有关进一步的说明，请参阅您的仪器的系统指南。
- 按照仪器的变性和稀释库指南操作。
- 对于HiSeq 2500和MiSeq系列，重要的是，用HT1稀释后，NaOH的最终溶液不超过1mm NaOH。大于1mm的氢氧化钠抑制模板杂交效率。
- 当变性NextSeq和MiniSeq的文库时，使用200 mM Tris-HCl pH 7.0，以确保NaOH在最终溶液中完全水解。因此，即使最终NaOH浓度大于1 mM，模板杂交也不会受到影响（见上文NextSeq和MiniSeq变性和稀释指南）。
- 对于高度结构化或GC丰富的库，在将池加载到仪器之前对库进行热变性时，簇密度一致性得到改善。此方法对于其他库是可选的。
- 测序文库NaOH变性，HT1稀释至最终上料浓度后，用热块96℃孵育稀释后的文库2分钟。
- 热孵育后，将试管倒置1–2次以混合。
- 迅速将图书馆移到冰水浴中5分钟。快速冷却步骤有助于将库锁定在单链形式。
- 立即进行集群生成。
- 考虑您的库的平均大小。由于聚类过程优先在片段的混合中放大较短的库，大型库的聚类效率往往低于较小的库。的Nextera库验证和聚类密度优化技术说明根据库的平均大小列出了加载浓度的指导方针。
- 排序时需要特别考虑缺乏多样性库确保一致的集群密度和良好的数据质量。有关低多样性测序指南，请参阅有关适当仪器的技术说明:米塞克,HiSeq,NextSeq和MiniSeq．