Nextera DNA Exome常见问题解答

通过在用SYBR染色染色的1％琼脂糖凝胶上运行样品（约10-100ng）的样品（约10-100ng）来评估基因组DNA的质量。在不存在较低分子量涂片的情况下，高质量，完整的基因组DNA在没有较低分子量的情况下表现为高分子量带（> 10,000bp）。低分子量涂抹可以表明存在RNA或降解的DNA。

为了在PCR和富集的文库中量化输入基因组DNA和DNA，使用基于荧光的方法，该方法特异于双链DNA，例如Quantfluor或Picogreen。可以使用Qubit DSDNA BR测定或QUBit DSDNA HS测定来确定GDNA的浓度。这些测定使用荧光染料，其对RNA上的双链DNA具有高度选择性，并且可以检测浓度范围为10pg /μl-1000ng /μl的样品。皮卡温染料也可用于精确测量DNA浓度。

有关更多信息，请参阅DNA输入建议部分Nextera DNA Exome参考指南.

尽管Nextera DNA外酶被优化以耐受DNA输入可变性水平，但是50ng的输入基因组DNA是最佳数据的靶标。重要的是要准确地量化输入基因组DNA，以产生高质量的正确尺寸库。使用基于荧光的量化方法进行输入基因组DNA。

有关更多信息，请参阅DNA输入建议部分Nextera DNA Exome参考指南.

随着Nextera DNA外酶，TDE2，添加一系列DNA的效果是最小的。该协议优化为50 ng输入DNA，建议使用此金额。然而，该协议已被验证为具有30-75个NG DNA输入的类似最终分析结果。

从FFPE样品中分离的DNA质量可以是高度变化的。由于这种可变性，非常困难使用该方案可靠地预测由FFPE样品制备的文库的质量。Illumina不支持FFPE或降解DNA作为此协议的输入。这并不意味着无法尝试尝试FFPE样本，但是源自该样本类型的失败库不符合Illumina的更换或故障排除。

Nextera DNA外显子组使用基于转座子的片段化，而TruSeq DNA外显子组使用另一种使用机械剪切的富集方案。

Truseq DNA外壳方法使其适用于Nextera标签不响应良好的DNA。Truseq DNA外壳协议是经过验证的Truseq纳米图书馆准备和浓缩套件的组合。

以下库准备和索引适配器组件可通过Illumina订购。从Illumina，根据实验的样本数量，订购库预备组件的一个目录编号和索引适配器组件的一个目录号。

以下富集和面板组件可通过IDT订购。根据IDT，根据实验的样本数量，订购丰富组件（阻塞器和锁定试剂）的两个目录号码以及面板组件的一个目录号。可以在其中找到更多信息IDT网站.

以下套件可用于使用Illumina试剂进行Truseq DNA Exome工作流程，用于图书馆制备和富集。这些套件包括索引适配器，不需要单独订购。

从基因组DNA输入需要9小时，直到文库准备好在流动细胞上加载，包括〜3小时的手按时。

此协议已使用库预备参考指南中指定的微高热系统进行了优化和验证。使用备用设备时无法保证可比性。

与太多图书馆过载的富集反应可能导致偏离目标读数的增加。相反，在富集反应中加载太少的图书馆可以导致较低的文库多样性，并增加重复测序读数。

可以汇集最多12个标签样本并处理协同方案的富集部分。但是，没有使用8 rxn×1 plex套件进行汇集。

使用基于荧光的方法来量化富集的库，具体用于双链DNA，例如Quantfluor或Picogreen。有关更多信息，请参阅“库预备参考指南”。

您还可以使用QPCR来量化最终丰富的库。有关更多信息，请参阅测序库QPCR量化指南.

使用基于荧光的方法来定量标签库，具体用于双链DNA，例如Quantfluor或Picogreen。有关更多信息，请参阅参考指南。

与使用用于杂交的热块相比，热循环仪导致在具有板的样品上的更好的一致性和更强烈的结果。通过在该步骤中使用热循环仪，100°C加热盖有助于防止大量样品蒸发。

该试剂盒包括足够体积的样品纯化珠试剂，以加工试剂盒的预期样品。请勿使用此协议使用任何其他制造商的珠子或列。

协议中有六个安全停止点。安全停车点位于以下步骤之后：

• 首次PCR扩增
  
• 第一次PCR清理
• 第一次捕获
• 捕获样品清理
• 第二种PCR济杂化
• 第二个PCR清理

有关存储详细信息，请参阅参考指南。

您可以一次准备一个样本。然而：

• 使用8-反应试剂盒时，处理和汇集8个样品是最经济的。但是，当使用8-反应1-复合试剂盒时，不执行池。
• 当使用12丛或288样本套件时，处理和汇集12个样本是最经济的选择。

可以通过协议一次处理1-96个样品。当处理少于每个套件的最大样本数量时，将试剂的等分试剂用于随后使用而不是反复解冻和冷冻相同的试剂管。

编码极端（45 MB）使用80 MEL OLIGOS。

用户提供物品的完整列表可在《图书馆准备参考指南》的耗材和设备部分找到。

有关更多信息，请参阅索引适配器池指南.

不，没有杂交时间范围。该方案已针对每个杂交优化30分钟

该尺寸选择步骤确保只有所需尺寸的碎片进入PCR，优化富集的最佳结果。

管方案在EPPendorf管中处理样品，建议加工≤16样品预富集。板协议采用96孔板，建议用于加工> 16样品预富集。

管材和板方案需要不同的耗材，磁台和孵育设备。期待在任一选项中的等效结果。但是，板选项可以在样品之间产生更一致的结果。

在富集期间，在DNA中可能发生突变。Oxo Q-得分可以弥补这些突变的速率。

该协议使用专有缓冲区来最少化这些突变。

预富集库产品的简档可以看起来与根据输入DNA的类型和质量所示的示例看起来不同。有时存在更大的分子量峰。该峰值的大小可以是可变的。但是，它对最终的极端度量输出没有影响，并且您可以继续执行协议。该峰值最常见于协议的放大步骤的结果。

使用Agilent Technologies 2100 BioAnalyzer来检查标签样本，预先丰富的图书馆和富裕的库的质量和预期尺寸分布。有关BioAnalyzer迹线和库大小分布的示例，请参阅“库预备参考指南”。预期生物分析仪配置文件的变化，因为它取决于输入DNA类型。

图书馆一般在〜200-500磅的范围内，主峰〜300-350 BP。

Hiseq 3000，Hiseq 4000，Nextseq 500，Nextseq 550和Novaseq 6000

是的，Basespace公共数据中存在示例数据集。

这是标记库的正常特征，与标记位点的序列上下文有关。

清单文件列出基因组区域和坐标，用于与图书馆预备套件进行丰富。数据分析需要在目标区域中的对齐和变体调用的表演文件。每种产品都有一个_目标地区及_探查清单文件。

从库准备工具包的产品文件页面下载清单文件。

人类UCSC版HG19，与基因组参考联盟构建37（GRCH37）相同。

不。

是的。从产品文件页面下载Bod文件。

使用HiSeQ分析软件丰富工作流程分析Hiseq数据，用于HiseQ数据。使用MiSeQ Reporter分析MiSeQ数据。看看HISEQ分析软件或者Miseq记者有关详细信息，请参阅支持页。

或者，Illumina序列呼叫输出文件（* .bcl）可以使用bcl2fastq converter软件进行多路分解并转换为FASTQ格式。然后，文件可以使用其他第三方软件包（例如，BWA和GATK）进行分析。如果用户使用Basespace进行分析，我们建议使用BWA或ISAAC浓缩分析工具。如果需要任何子采样，请使用FASTQ Toolkit。