全部崩溃
|全部展开
Nextera的Mate Pair协议已经通过s系列Covaris声波发生器进行了验证。根据Covaris的说法，e系列(E210和E220)在使用等效设置时的性能应该相似(如果使用E210，则遵循S2的推荐设置;如果使用E220，请按照S220的设置进行设置。然而，这些设置可能不能直接转移，并且按照协议中建议的那样使用s系列之外的Covaris可能需要进行优化。
无凝胶方案的建议输入量为1μg基因组DNA，以从48个样本中生成48个文库。遵循凝胶增强方案时，使用4μg基因组DNA作为输入。这一数量准备了12个库，每个样本有大小选择，或多达48个库，每个库从12个输入中选择4个大小。
是的，虽然标记反应可能会产生平均插入大小为5 kb或更多的片段分布，但小片段的循环效率远远高于大片段。因此，测序数据中检测到的平均片段大小可能比标记反应的Bioanalyzer电泳图所建议的小得多。
Illumina Nextera Mate Pair文库制备工具包生产的文库大小范围广泛，通常在300-1500 bp之间，峰值集中在600-700 bp左右。出于排序目的，无需进一步选择库的大小。尽管最大的片段可能不能有效地聚集和排序，但它们在文库中的存在并不有害。
具有大小选择的Nextera Mate Pair Gel Plus协议旨在生成具有较窄大小分布和较大中间片段大小的配对库。这是通过使用基于凝胶的大小选择过程来选择所需大小范围的DNA来实现的。片段分布窄的配对库将有助于准确的结构变异检测。它还将通过提供跨越较大重复区域的成对读取信息，帮助简单和复杂基因组的从头组装。
然而，生成凝胶加库的难度随着片段长度的增加而增加。与较小的配对片段大小的库相比，较大的片段长度的库预计具有更低的最终库产量和更低的库多样性，更具有挑战性。为了提高在执行Gel-Plus过程时生成库的健壮性，对协议中的几个步骤进行了优化，并提供了指导方针。
Nextera Mate Pair Gel-Free协议是一种低输入(1 ug)、简单、健壮的协议，可生成分布广泛的片段大小的Mate Pair库，从1.5 kb到15 kb，中间插入大小约为3 kb。无凝胶协议可靠地产生具有更少重复的高多样性库，允许对库进行更深层次的排序。无凝胶偶对库的可能应用是从头组装(特别是较小的基因组)和结构变异检测研究。虽然目前Illumina还不支持无凝胶协议，但该协议也可能适用于自动化。
安瓿净化程序已由Illumina使用Axygen Maxymum Recovery 1.7 ml微型离心管和Invitrogen磁力支架（第#CS15000部分）进行验证，如用户指南中耗材和设备清单所述。当使用其他微离心管/管格式或其他磁铁时，无法保证类似的性能，如库的产量和尺寸分布，协议可能需要更长的时间。
看到Illumina测序平台上Nextera配对读取的数据处理对于配对连接序列。该文档还包含有关如何执行适配器修剪和分析配对数据集的信息。
Nextera Mate配对套件采用Nextera和TruSeq技术。输入的gDNA最初用Nextera转座酶标记，该转座酶在DNA分子末端添加配对连接适配器。
然而，在循环后，DNA第二次断裂，并添加TruSeq适配器。随后的PCR、聚类和测序步骤使用TruSeq适配器。
因此，出于测序目的，完成的Nextera Mate Pair文库被认为是TruSeq DNA文库，必须使用TruSeq测序引物和协议进行测序。