SureCell WTA 3´图书馆准备工具包常见问题解答

该工作流程从单细胞制备3 '标记RNA-Seq文库，用于Illumina测序系统上的整个转录组基因分析。该方案需要Bio-Rad ddSEQ单细胞隔离器(SCI)和Illumina | Bio-Rad SureCell WTA 3’库制备试剂盒中的试剂，用于ddSEQ系统分离单细胞和条形码单个转录组。

SureCell WTA 3'库制备试剂盒只能与Bio-Rad ddSEQ单细胞隔离器一起使用。在继续之前，请确认ddSEQ单单元隔离器已安装且运行正常。请参阅Bio-Rad ddSEQ单细胞隔离仪使用手册，了解如何操作ddSEQ单细胞隔离仪、使用和维护的最佳实践。yobet亚洲

每个ddSEQ单细胞隔离盒有4个细胞输入孔，可以装载多达4个独特的样品，平均每个样品300个单细胞输出。

不，ddSEQ单细胞隔离器将单细胞和条形码共封装到亚纳升液滴中，为单细胞分析创建高度并行化的库。

在单元准备期间创建一个单单元悬浮液，以便在ddSEQ单单元隔离器上加载。在装上药筒之前，要确保细胞被良好地悬挂和存活。

SureCell WTA 3’8样品和24个样品套件用于不同的样品编号。

8样例配置包含4个框。

24个样例配置包含10个框。

是的，协议生成滞留库。通过在第二链缓冲液(SSB)中用dUTP取代dTTP来实现链特异性。在第二链合成中加入dUTP在扩增过程中有效地猝灭了第二链，因为在实验中使用的聚合酶不会合并超过该核苷酸。

自制造之日起一年内。工具包标签提供了确切的过期日期。Illumina保证从收到之日起至少三个月。

雨水移液管和移液管提示是SureCell工作流程中以下步骤所必需的:

• 制备单细胞悬液(P200或P1000单通道)
• 评估细胞数量和活力(P20单通道)
• 制备细胞和条形码悬浮混合物(P20单通道，P200单通道)
• 分离单细胞(P20单和多通道，P50多通道，P200多通道)

见消耗品和装备部分SureCell WTA 3 '图书馆准备参考指南获取更多信息。

清理程序仅使用规范中指定的磁支架进行优化和验证SureCell WTA 3 '图书馆准备参考指南．需要两种不同类型的磁支架，两者都需要完成该协议。这些磁体是不可互换的，当使用其他磁体时，性能也不保证有可比性。如果您选择使用不同的磁体，则可能需要优化培养时间，并注意限制库的长度和产量，以确保成功的结果。

有两个主要方面会使磁体不适合该协议:

1. 如果磁铁太弱，不能把珠子从溶液中吸出来
2. 如果磁铁的几何形状使其难以清除整个上清。在清理步骤中，用上清液去除珠粒会大大降低最终文库产量，导致测序结果较差。

的SureCell WTA 3 '图书馆准备参考指南包括以1:1混合运行混合物种控制样本的验证方案，以评估HEK和3T3混合物种串扰和双态细胞。该方案可与其他样本并行作为对照。

Illumina和Bio-Rad已经验证了Bio-Rad C1000和Bio-Rad T100热循环器。其他热循环器可能需要额外的优化。

该工作流程已通过市售细胞系，小鼠(A20, NIH-3T3)和人(HEK-293, BJ)， Jurkat, K562和初级角质形成细胞进行了各种细胞直径和IFC大小级别的测试。所提供的方案可作为许多粘附或悬浮细胞系的起点。然而，分离、过滤、洗涤、定量和分配缓冲条件可能需要额外的优化和适合您的细胞类型或细胞源的特定技术。

当第一次使用SureCell WTA 3’文库准备试剂盒检测或使用新细胞类型时，我们建议在开始完整实验之前准备额外的细胞，用于优化细胞解离条件。在优化细胞分离时考虑以下方法:

• 胰蛋白酶的类型或替代酶的典型你的细胞类型
• 胰蛋白酶化的培养时间和温度
• 移液强度
• 使用的血清学移液管或微量移液管尖端的类型(直径)

混合物种控制实验的验证方案可以在SureCell WTA 3 '图书馆准备参考指南，描述可用于评估工作流程的控制协议。

加载浓度为2500 cells/μl±10%的单细胞悬液(2250-2750 cells/μl)。

高活力(>95%)和细胞完整性是必要的。死亡或受损的细胞可以将核酸释放到细胞悬浮缓冲液中。来自这些细胞的背景信号通过后续步骤保留下来，并可能影响结果分析的质量。台盼蓝是一种用户提供的消耗品，用于评估可行性。

是的，ddSEQ单细胞隔离器的单细胞封装需要在液滴生成之前完全分离细胞以形成单细胞悬浮液。悬浮液中存在的细胞聚合体将显著增加细胞双联体或多联体的概率，使数据解释可能更加困难。根据使用的方法或细胞计数设备，多重计数也会影响细胞计数的准确性。

准确的细胞计数是实现目标细胞吞吐量和避免细胞多胞胎的关键。Illumina和Bio-Rad已经验证并推荐使用自动细胞计数器(Bio-Rad TC20)进行准确的细胞计数。使用其他单元格计数器时，不能保证性能的可比性。

细胞必须始终保持低温，以防止在液滴形成之前细胞结块。在处理细胞和试剂时，请仔细遵循规程说明，以确定该步骤是在室温下进行还是在冰上进行。

我们强烈建议将单细胞悬液准备得尽可能接近装入ddSEQ单细胞隔离器。如果您需要分期，请在加载前将悬浮细胞放置在冰上长达1小时，但在加载前请确保细胞处于单个细胞悬浮状态。

一个ddSEQ墨盒可以装载多达4个独特的样品。如果你只想加载1个样品，用珠状悬浮混合物和细胞悬浮混合物填充剩余的输入孔。

在细胞准备好之后，在第二链合成开始之前没有安全的停止点。立即执行协议中的每个步骤。细胞制备和处理过程中的延迟会导致样品失效。在你开始之前，确保你有所有需要的消耗品和设备。

在第二链合成后，在合成第二链cDNA、清理cDNA、扩增Tagmented cDNA和清理文库后存在安全停止点。

ddSEQ单细胞隔离器一次可以制备1个ddSEQ墨盒。但是，在为第一个墨盒完成“隔离单个单元”步骤后，可以处理第二个墨盒。请参阅SureCell WTA 3 '图书馆准备参考指南用于加工2个墨盒。如果需要处理2个以上的墨盒，请联系Illumina技术支持。

本协议中的试剂有颜色编码的盖子，以识别相关的悬浮液混合物与ddSEQ筒架中的彩色孔，以便于装载。

• 红色的帽子是用来制造细胞酶混合物的试剂
• 蓝色的帽子标识用于创建条形码悬浮混合物的试剂

不，AMPure XP珠不用于此制备。相反，净化珠(SPB)提供的工具包清洁步骤。

塑料密封可以产生静态和冲击封装的样品，这可能会增加多胞胎的机会。

是的，需要索引DNA适配器(N7XX)来添加全长适配器序列。如果没有这个序列，该库将无法与Illumina测序仪兼容。

不管细胞样本是相同还是不同，每个孔使用不同的DNA适配器。SureCell WTA 3 ' Library Prep Kit提供了足够的指标，可以为每口井使用不同的指标，从而可以通过分析来跟踪井的情况。

该协议使用Nextera索引(N7XX)。索引名可以在SureCell WTA 3 '图书馆准备参考指南．索引序列列在Illumina适配器序列文档．

ddSEQ生成液滴大约需要5分钟。仪器指示灯闪烁绿色，表示正在进行细胞隔离。当3个指示灯均为纯绿色时，隔离完成。

打开仪器后，被封装的样品在ddSEQ筒的输出孔中会出现浑浊。注意是否有井看起来清澈或空的，因为液滴产生可能在这些位置失败了。

在开始此试验之前，请观看SureCell WTA 3'库准备:最佳实践培训视频培训页面。本视频涵盖了SureCell WTA 3 '库准备工具包工作流程的关键步骤和最佳实践。

另外，请参阅Bio-Rad ddSEQ单细胞隔离器说明书，用于装载墨盒和液滴转移的最佳实践。

以下是一些关键步骤:

1. 当从墨盒输出孔中取出封装样品时，轻轻缓慢地(5秒/50 μ l)移液管样品。
2. 在“打破乳液”步骤中，目视检查样品，以看到已经形成了2层(底部是油层，顶部是水层)。注意是否有井只有1层。在接下来的步骤中，试剂将只添加或混合在最上面的含水层。
3. 在“清理第一链合成”步骤中，将添加纯化珠(SPB)并在水层中混合。一定要将珠子与水层充分混合，使水层表面呈均匀的棕色。如果在水层中看到梯度，继续混合，然后进行下一步。

是的，您可以通过工作流检查多个点的进度:

• 在ddSEQ上的“隔离单细胞”步骤之后，从视觉上确认输出孔中的样品具有浑浊的外观，并注意任何空孔或清晰的孔。
• 在清理cDNA后，我们建议您在安捷伦技术2100生物分析仪上使用高灵敏度DNA芯片运行1 μ l未稀释的文库。我们为比较提供了一个示例跟踪。典型的cDNA谱在~ 400-8000 bp之间。> 2 ng的cDNA产量足以进行tagmentation步骤。
• 在评估文库步骤中，使用高灵敏度DNA芯片在安捷伦技术2100生物分析仪上运行1 μ l未稀释的文库，以确定最终文库的大小和浓度。提供了一个示例跟踪以供比较。典型文库在300 ~ 1000 bp之间分布广泛。各种各样的文库可以测序，平均片段大小小至450 bp，大至1200 bp。如果你看到100-300bp大小的小产物，不要进行测序。强烈建议进行额外的珠子清理，以去除这些较小的产品。

典型的库产率为2-10 nM。根据你的实际库产量，将样品归一化到2 nM。

BioAnalyzer推荐用于cDNA Clean Up后的cDNA定量和测序前的最终文库。区域线应设置在200-800 bp之间，以确定平均片段大小和文库产量。Illumina不建议使用量子比特或qPCR等荧光测定方法对最终文库进行定量。

中提供了修改的加载浓度SureCell WTA 3 '图书馆准备参考指南并基于BioAnalyzer定量。如果你用另一种方法量化，你可能需要优化加载浓度。

该库与MiniSeq, MiSeq, NextSeq 500, HiSeq 2500和HiSeq 3000/4000兼容。数据要求使该检测方法最适合NextSeq 500和HiSeq平台。

必须设置成对的末端运行，因为Read 1将对单元条码和UMI转录本序列进行排序。Read 2将对cDNA插入物进行测序。推荐的测序长度为68 x 75。Illumina建议Read 1的周期长度为68，以避免Poly a尾部的测序。

库是单索引的。

是的，SureCell WTA 3 '库准备套件附带50µM的SureCell测序引物(在盒子3 / 4中)，仅与SureCell库和PhiX兼容。SureCell测序引物用于Read 1，并添加到自定义引物位置(请参阅自定义引物文档以获取测序仪器)。如果没有使用SureCell测序引物，测序运行将不会成功。看到SureCell WTA 3 '图书馆准备参考指南获取如何使用测序引物的说明。

当设置样本表或在BaseSpace Sequence Hub中设置PrepTab时，您需要指定自定义引孔的使用。

我们建议在1%的PhiX控制中增加峰值，作为对齐和错误率计算的积极控制。要了解更多信息，请参阅Illumina网站上的PhiX Control v3支持页面。

数据集可在BaseSpace公共数据页面获取。

在BaseSpace Sequence Hub中，使用SureCell RNA单细胞应用程序来分析数据。

对于分析，单细胞RNA应用程序支持多个物种，包括人类(hg19)、小鼠(mm10)、大鼠(rn5)、斑马鱼(danRer7)、苍蝇(dm3)和秀丽隐杆线虫(de10)。还支持人(hg19)和小鼠(mm10)混合物种实验。

是的。有关更多信息，请联系Illumina技术支持。

使用Illumina实验管理器(IEM) v1.13或更高版本。使用IEM生成的样例表将包含BaseSpace或bcl2fastq2 v2.18或更高版本的正确UMI设置。

该应用程序是专门设计的分析与SureCell WTA 3 '库准备工具包准备的样品。该应用程序尚未被验证用于分析用任何其他试剂盒制备的样品。

SureCell RNA单细胞应用程序旨在分析使用SureCell WTA 3 '文库制备试剂盒制备的样品。这个应用程序执行读取比对，细胞和转录本赋值，细胞和基因计数，过滤，并计算和报告单细胞指标。SureCell RNA单细胞工作流程包括以下主要步骤。参考SureCell RNA单细胞应用程序用户指南，了解工作流程的详细分解:

1. 使用STAR将reads 2与完整的参考基因组对齐
2. 生成一个带注释的BAM文件，其中每个对齐都标记了单元格条形码和UMI
3. 计数UMIs以生成基因表达计数
4. 根据每个单元格条码的UMIs数量筛选单元格
5. 计算对齐，细胞和基因指标
6. 生成聚合和每个样本的PDF报告

SureCell RNA单细胞应用程序使用STAR校准器将read 2与整个参考基因组进行校准。BAM文件中每个对齐的读取都使用来自读取1的单元条码和UMI序列进行标记。

主要输出文件包括BAM格式的对齐读取，每个细胞和每个样本的基因计数，以及包含单细胞RNA指标的PDF报告。更多详细信息，请参考SureCell RNA单细胞应用程序用户指南。