TruSeq甲基捕获EPIC库准备工具包常见问题解答

TruSeq甲基捕获EPIC测序面板包含的内容跨越了整个人类甲基组，包括CpG岛、海岸、货架、增强子、启动子区域、开放染色质中的位点和基因体。

该小组基于包含在Infinium人类甲基化EPIC BeadChip中的内容，以及由ENCODE、FANTOM5、表观基因组路线图联盟和客户要求确定的额外重要区域。

TruSeq DNA甲基化用于整个基因组亚硫酸氢盐测序，使用的化学方法与TruSeq甲基捕获EPIC不同。

Pearson相关值为0.96。有关更多信息，请参阅TruSeq甲基捕获EPIC数据表。

预富集的样品数量取决于试剂盒:

有关更多信息，请参见TruSeq甲基捕获史诗库准备参考指南．

对于LT和HT配置，套件包含5个盒子。

寡头是80名中东人。

目前，Illumina不提供定制设计的TruSeq甲基捕获EPIC面板。

对于大多数目标区域，捕获单链，测序数据是高链的，除了区域的子集。

因为亚硫酸氢盐测序将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，尿嘧啶最终在最终序列中变成胸腺嘧啶，C>T SNPs可能会被误认为“未甲基化”胞嘧啶。对于含有cpg和共同SNPs的区域(在EUR超种群1000基因组数据中MAF >5%)，探针被设计来捕获两条链。因此，如果只对一条单链进行测序，CpGs上的高频率snp就会被掩盖，现在可以通过观察这些区域的第二条链来调用这些snp。如果需要在未甲基化的CpG位点上进行低频SNP调用(<5% MAF)，则应使用其他合适的技术(例如，对未转换的样本进行测序)。

Lister, Ecker及其同事(自然界2009)发现互补链上99%的CpG位点具有相同的甲基化状态。因此，在大多数情况下，互补链的甲基化可以从单链甲基化数据推断出来。

自生产之日起一年。试剂盒标签提供了确切的有效期。Illumina保证从收到之日起至少三个月。

使用《图书馆准备参考指南》中指定的磁性支架对清理程序进行了优化和验证。使用其他磁铁时，无法保证具有可比性能。

如果你选择使用不同的磁铁，测试样品必须在磁铁上停留多久。时间可能与协议不同。

对于该协议，磁铁的次优特性有两个方面:

• 磁铁太弱，不能充分地把珠子从溶液中拉出来。
• 磁铁的几何形状使其很难干净地清除整个上清液，而不清除上清液中的任何珠子。

Illumina建议使用以下一个或多个推荐的阳性对照样本。这些阳性对照样本可用于甲基化状态的控制。

正常的样品: HCC1187 normal (BL) (ATCC，目录# CRL2323-D)， NA12878(科瑞尔研究所，目录# NA12878)

癌症样本：HCC1187乳腺癌肿瘤（ATCC，目录CRL2322），HeLA（生物链，目录D1255811），Jurkat（生物链，目录D1255815）

试剂盒中提供了协议所需的所有珠子。

试剂盒中提供了协议所需的亚硫酸氢盐转换试剂。

有关更多信息，请参阅工具包文档和文献页面上的白皮书。

输入基因组DNA为500 ng。

Illumina没有验证少于500ng的工作流。当使用少于500 ng的输入DNA时，观察到相应的重复数增加。因此，图书馆可能需要增加排序深度以达到所需的覆盖水平。

Illumina已经测试了1µg，这产生了更少的重复，因此更好的覆盖。

本协议尚未通过FFPE样本验证。

基因组DNA的大小由于体积大而难以确定。然而，Illumina建议检查DNA质量，只使用2.6 /280比率介于1.8-2.0之间的gDNA。

使用基于荧光的定量方法，包括Qubit或PicoGreen，以准确量化gDNA。

基于紫外分光光度计的方法，如NanoDrop，测量样品中存在的任何核苷酸，包括RNA，双链dna，双链dna和游离核苷酸，这提供了一个不准确的测量。

在RNase/DNase游离水中或pH值为8.5的10mM Tris-HCl中稀释起始物质。避免使用含有EDTA的缓冲液，如TE或AE。

不推荐使用DEPC水。污染物会抑制部分反应。

LT和HT试剂盒都包含足够的试剂，用于指示数量的样品在只有四倍。您可以使用不同的plexations (single plex, two plex)和附加的PCR循环来完成这个方案，但是当使用的样本少于最大数量时，一些试剂就会耗尽。

样品在富集前进行多路复用。如果在一个流池上装载多个样品，在测序前样品也可以多路复用。

TruSeq LT Set B索引尚未通过此工作流验证，因此Illumina不支持。

指南可在索引适配器池指南．

该试剂盒专为4倍样本设计。试剂盒中的某些试剂如果运行在4倍以下，可能会耗尽。

在设计用于单索引排序的低复杂度索引池时，总是为每个已排序的索引使用至少两个唯一且兼容的条形码。下表描述了用每个集合中的适配器索引管生成的2-4个样本可能的池策略。

未列出所有颜色平衡池。使用IEM检查颜色平衡。有关更多信息，请参阅Illumina实验管理器用户指南．

LT包

AD002、AD004、AD005和AD006的任何2路、3路或4路组合。

HT包

该协议对使用Covaris碎片进行剪切进行了优化。Illumina不支持或测试其他方法，可能导致低产量、意外大小分布或库故障。

协议中有三个安全停止点。安全停车点位于以下步骤之后：

• DNA片段
• 放大丰富图书馆
• 清理放大充实库。

关于存储的详细信息，请参见参考手册。

所有冷冻运输的试剂都能经受冻融过程。像磁珠和SPM这样的部件永远不会被冻结。

Illumina公司的专利方法确保了将2个不同的适配器以所需的方向连接到DNA片段的相反两端。PCR选择这些，并最终确定构建，以便在流动细胞表面杂交。可以通过对连接片段进行测序来确定适配器序列，但仅凭序列信息不足以揭示该方法。

要使用此试剂盒制备未转化的文库（不用于甲基化调用），请跳过亚硫酸氢盐转化并直接转到放大富集文库步骤。

使用安捷伦2100生物分析仪检查Covaris剪切样本和最终库的质量和预期大小分布。有关生物分析仪痕迹和库大小分布的示例，请参阅参考指南。

预期峰值在150-170 bp之间。DNA在100-300 bp之间的预期分布为> 60%。在这个范围内，DNA的平均大小是180-200 bp。参见参考指南中的生物分析仪痕迹示例。

最终库的预期大小范围是~250 bp ~ ~1 kb。预计插入的中位尺寸为180-200 bp。参考指南提供了生物分析仪痕迹示例。

预期用量为3-12 ng/µL，结果为10-40 nM。

使用双链DNA结合染料（如量子比特或微微绿色）的qPCR或荧光定量分析可用于量化最终文库。

Illumina不支持在流单元的同一车道上运行由不同库准备套件准备的库。这种做法可能会影响集群密度、数据分布和运行质量。

TruSeq Methyl Capture EPIC客户将于2016年第四季度获得实时分析(RTA) v2.7.7版本。它将于2017年发布给Illumina的所有客户。

下表显示了获得> 40倍平均覆盖率和> 90%≥10倍覆盖目标碱基所需的推荐库数。这个套件包括多达12个库的索引适配器。

推荐5,500万个读取，以最大化覆盖的cpg数量>为10x， >为40x。

建议读取长度为2 * 101。

这个试剂盒是单指标的。

如果运行正在上传到BaseSpace或BaseSpace现场，则可以使用BaseSpace Core App- MethylSeq和BaseSpace Labs App- MethylKit分析数据。

MethylSeq提供比对分析，MethylKit提供样本间比较分析。

有关MethylSeq的更多信息，请参见MethylSeq BaseSpace应用程序文档．

有关MethylKit的更多信息，请参阅MethylKit BaseSpace Labs页面．

Illumina序列基调用输出文件(*.bcl)可以使用bcl2fastq转换软件进行多路分解并转换为FASTQ格式。这些文件可以用于其他第三方软件包的分析，如Bismark和MethylKit。

Illumina无法为第三方软件的使用提供支持。与软件分析和使用有关的任何问题直接联系软件资源。