TruSeq链mRNA

TruSeq链RNA文库制备试剂盒用于构建与Illumina测序平台兼容的下一代测序链RNA文库。它以聚腺苷化的RNA(包括mRNA和非编码RNA与聚腺苷化)为目标，通过寡聚dT纯化文库制备，只需100 ng的输入RNA。TruSeq strand mRNA library preparation kit是一个精简的工作流程，可以使用高质量总RNA (RIN>8)或从高质量总RNA (RIN>8)中纯化的mRNA/ rrna耗尽RNA。

TruSeq strand mRNA特异靶向多聚腺化RNA(包括编码RNA和非编码聚腺化RNA)， TruSeq strand Total RNA基于rRNA耗尽，靶向编码RNA和长链非编码RNA制备RNA文库。

TruSeq链mRNA需要高质量RNA（RIN>8）作为输入，TruSeq链总RNA可用于降解/FFPE样品。

我们提供两个套件来支持以下样本编号。

以下库准备和索引适配器组件可通过Illumina订购。从Illumina订购一个库准备组件的目录号和一个索引适配器组件的目录号，这取决于您的实验的示例数量。

单索引适配器在管中提供。每个i7索引的适配器在其管中与同一个不包含(i5)条码的通用适配器配对。

组合双索引适配器是镀对适配器，这样每个i5索引适配器将与每个i7索引适配器在整个板的一个阵列矩阵中配对。

唯一双索引适配器是镀对适配器，这样每个i5索引适配器和每个i7索引适配器只在一个板上使用一次。通过独特的双索引适配器，索引跳读的识别和过滤允许客户有信心地多路复用他们的样本。

Illumina建议在Illumina测序器上使用独特的双索引适配器进行库准备和测序。

不，推荐的SuperScript II和agcourt AMPure XP 60毫升试剂盒是用户提供的。

是的。如果样品能在预期覆盖范围内覆盖，这将允许复配多达24个样品。请参阅排序部分中的“推荐的阅读长度和类型”。

我们建议TruSeq链mRNA文库制备试剂盒使用高质量总RNA或由RIN≥8的高质量总RNA纯化的RNA，以防止3 '偏倚。

如果我们使用来自人类样本的降解或FFPE RNA，并希望以mRNA为靶点，我们可以考虑TruSeq RNA Access作为一种替代方法。

如果我们正在研究来自其他物种的降解或FFPE RNA，可以考虑TruSeq链总RNA，其靶向mRNA以及长非编码RNA。

最佳260/280和260/230的清洁RNA样品的比率预计为〜2.0和≥2.0。

0.1-4µg总RNA或10-100 ng分离的mRNA或rrna耗尽的RNA都是支持的，并期望得到类似质量的文库。

推荐使用荧光测量方法，如Qubit或Ribogreen。基于NanoDrop等UV/VIS分光光度法扫描的测量将量化所有的核酸，这可能会导致对输入材料的过高估计，影响库的质量。

推荐DNase治疗。这将确保输入材料的准确定量，并防止任何可能的干扰，污染的gDNA在图书馆准备。

所有聚腺苷化分子被分离和测序;多聚腺苷化的非编码RNA也可以进行测序。

看到TruSeq链mRNA参考指南，以了解如何使用纯化的RNA作为输入。

信使RNA分离协议依赖于纯化含有poly-A尾巴的RNA物种。由于原核mRNA不聚腺苷化，TruSeq链mRNA不适合这些生物。

作为替代，我们可以使用10-400 ng的rrna耗尽的原核RNA作为输入，跳过最初的mRNA纯化步骤。参见“我可以使用纯化的mRNA或rrna耗尽的RNA作为输入吗?””上面。

关于rRNA耗尽选项，请参考Illumina的Ribo-Zero产品组合．

Illumina建议使用Agilent Technologies人UHR总RNA（目录＃740000）作为阳性对照样品。

内联控制是将核酸片段添加到文库制备样品中作为内部控制，以检验文库制备过程中某一特定步骤是否成功。这有助于在分析测序数据时排除文库准备过程中的故障，并占总测序数据的约0.1%。

使用内联控件是可选的;如果不使用内联控件，可以添加RSB缓冲区。

使用较大的片段大小是可能的，但是，我们发现较短的片段大小产生最好的覆盖。更多信息请参阅参考指南中的附录A。

协议中的安全停止点包括:

• 第二链CDNA合成和清理
• 完成适配器的结扎和清理
• PCR后扩增和清除

这些测试的安全停止点在参考指南中标记。

由于中间产品可能是有限的，我们没有测试中间的QC点。

通过在第二条链标记混合物（SMM）中用dUTP替换dTTP，可实现链特异性。在第二条链合成中掺入dUTP可在扩增过程中有效地淬灭第二条链，因为分析中使用的聚合酶不会掺入该核苷酸。

这种特异性伴随着放线菌素D添加到第一链主混合法D (FSA)中，这可以防止在第一链合成过程中虚假的DNA依赖合成，允许只依赖rna的合成。

Illumina公司的专利方法确保了将2个不同的适配器以所需的方向连接到DNA片段的相反两端。PCR选择这些，并最终确定构建，以便在流动细胞表面杂交。

在准备库时，重要的是要为将被复用在一起的每个样本选择唯一的索引，并且这组索引是颜色平衡的。

在索引读取期间的颜色平衡是必要的，以确保正确的图像配准。为了确保颜色平衡，确保每个循环处的每个颜色通道（红色或绿色）的混合，使得图像被正确注册，并且将以高质量产生基准呼叫。如果没有调用基础，则索引读取可能无法与样本表中指定的序列匹配，从而导致解复用故障。

请参考以下两个问题“如何为我的样本准备选择最佳的索引组合”和“如果我汇集的样本数量较少(<12)，我如何选择索引组合”以获得更多信息。

根据环境变异性，可能需要更长的干燥时间和井中剩下的乙醇的量。

采用qPCR对文库进行定量分析。为了实现均匀的池化，在池化之前应该对样本进行量化。

我们测试了在-20ºC下保存dsDNA库长达7天。对于较长的存储时间，Illumina建议将Tween-20添加到0.1%的最终浓度，并将集中的库存储在LoBind管中。还建议在测序前立即进行文库QC和定量。

120-130 bp左右的峰值可能代表适配器二聚体。这些可以通过一个额外的珠清理步骤来移除。

所有现有的集群生成套件都是兼容的。

Illumina不支持在流单元的同一车道上运行由不同库准备套件准备的库。这种做法可能会影响集群密度、数据分布和运行质量。

下载Illumina公司实验马槽并选择您在设置Sample Sheet时为实验选择的索引适配器选项。

如果我们在NextSeq系统上排序，我们可以在BaseSce或BaseSpace上设置PREPTAB中的索引信息到Baseaspace上的Demultiplex。

DNA扩增后，链信息通过连接适配器的方向性来维持。简而言之，库中适配器的方向和Illumina平台上的测序方向决定了Read 1序列将与DNA的反义链相同，这也是第一条cDNA链。

只有第一链cDNA被扩增和测序。

正在进行的项目可以保持他们当前的配置和工作流（非搁浅），而不是在研究的中间改变协议。

如果我们需要比较来自搁浅排序数据和非搁浅排序数据，从配对端搁浅运行池读取相当于从非搁浅单次运行池读取相同数量的数据(即，读1和读2的200万次读加在一起(共4 M)相当于一个非定向库的读1的400万次读。

在HiSeq 2500和HiSeq 3000/4000上运行时，样品表是可选的，除非使用BaseSpace Sequence Hub或BaseSpace现场序列Hub进行数据分析。此外，使用HiSeq 2500运行的样本表，可以在运行期间查看测序分析查看器(SAV)的索引标签上显示的数据。

NextSeq和MiniSeq运行也不需要样本表来启动运行。如果数据正在流向BaseSpace Sequence Hub或使用BaseSpace现场序列Hub，设置run Prep选项卡将允许FASTQ生成并在BaseSpace的indexing QC选项卡上可视化索引数据。

对于在任何排序仪器上运行，如果使用BCL2FastQ2转换软件执行多路分解，则需要样品表。

Miseq另一方面运行，在设置运行时需要样品表。

Illumina建议您在进行库准备之前使用Illumina实验管理器(IEM)软件创建样本表，以确定适当的索引组合。

在RNA测序实验设计中，读取长度和格式（单读与双读）是重要的考虑因素。下表提供了一些需要考虑的因素的指导。这些建议基于内部和外部数据，但并不代表严格的截止值。根据多个变量以及用户偏好，单个项目的需求可能会有所不同。需要查阅文献以获取最新的资源。

由于TruSeq链RNA分析的方向性，配对末端测序捕获RNA片段的两端。因此，配对末端测序有助于数据比对、新转录本的发现和PCR重复序列的鉴定。

在BaseSpace Sequence Hub上使用RNA-seq alignment和Cufflinks Assembly & DE应用程序来分析数据。

RNA-seq Alignment应用程序将执行读取比对、变体调用、读取计数和检测RNA融合。另一方面，Cufflinks Assembly & DE应用程序将执行新的转录本组装、差异表达分析和FPKM丰度估计。

目前不支持对仪器进行分析。

是的，虽然TruSeq RNA v2库不包含搁浅信息，但TruSeq搁浅mRNA数据可与TruSeq RNA Sample Prep v2数据相比较。

RNA-seq Alignment应用程序报告% strand reads，这是一个计算百分比对齐的Read 1读，映射到反义gDNA链，和百分比对齐的Read 2读，映射到义gDNA链。