TruSeq RNA样品准备试剂盒v2常见问题

TruSeq DNA和RNA v1试剂盒不再可供订购。请联系您当地的客户经理，以获得转换到最新版本的帮助TruSeq RNA和DNA样本准备包用于排序项目。

TruSeq strand RNA HT适配器板与TruSeq RNA library Prep Kits不兼容，因为协议和试剂不同。

TruSeq DNA和RNA样本准备试剂盒- A组

• V1-包含足够的试剂和适配器处理48个样品。每个试剂盒包含6个独特的指标，每个指标足以用于8个单独的样品。对这些指标进行了优化，可用于DNA样品的低复杂度多路复用。索引:2、4、5、6、7、12。
• V2/LT-包含足够的试剂和适配器处理48个样品。每个试剂盒包含12个独特的指标，每个指标足以用于8个单独的样品。指数:2、4、5、6、7、12、20、21、22、23、25、27。

TruSeq DNA和RNA样本准备试剂盒- B组

• V1-包含足够的试剂和适配器处理48个样品。每个试剂盒包含6个独特的指标，每个指标足以用于8个单独的样品。与优化套件一起使用的补充套件。索引:1、3、8、9、10、11
• V2/LT-包含足够的试剂和适配器处理48个样品。每个试剂盒包含12个独特的指标，每个指标足以用于8个单独的样品。与优化套件一起使用的补充套件。索引:1、3、8、9、10、11、13、14、15、16、18、19

虽然Illumina在TruSeq Sample Prep v2套件中提供额外的索引适配器，但填充量保持在8个样品，以最大限度地减少对协议的破坏。v2试剂盒被其他组件限制为每个试剂盒48个样品。这也为客户如何使用索引适配器提供了更大的灵活性。

对于一些库的准备，AMPure XP珠用户提供从贝克曼-库尔特基因组。更多信息请参阅适当的TruSeq DNA或RNA库准备指南。

TruSeq DNA和RNA文库制备不提供仅限低聚物的试剂盒。

Illumina使用绿色激光对G/T碱基进行测序，使用红色激光对a /C碱基进行测序。在每个循环中，每个颜色通道至少需要读取两个核苷酸中的一个，以确保正确的配准。保持正在排序的索引读的每个基的颜色平衡是很重要的，否则索引读排序可能会由于注册失败而失败。对于少量样本的汇集策略，请参阅您正在使用的工具包的库准备指南中的适配器管汇集指南部分。此外，建议在进行样品准备之前，在Illumina实验经理(IEM)中创建一个样品表，以确认未列出的适当的指数组合。

当第一次接收时，再悬浮缓冲区应存储在-25ºC至-15ºC。初始解冻后，试剂可保存在2ºC至8ºC，供整个方案使用。

TruSeq套件支持整个板块的许多低plex池选项。其中一些组合在索引适配器池指南．如果您设计了自己的颜色平衡池，Illumina强烈推荐使用Illumina实验经理检查颜色平衡池。

Illumina公司的专利方法确保了将2个不同的适配器以所需的方向连接到DNA片段的相反两端。PCR选择这些，并最终确定构建，以便在流动细胞表面杂交。可以通过对连接片段进行测序来确定适配器序列，但仅凭序列信息不足以揭示该方法。

应尽量减少PCR循环的数量，以避免扭曲文库的表达。Illumina推荐了15个PCR循环，这已经被证明在覆盖率、重现性和材料数量方面提供了最好的性能。虽然Illumina不推荐，但如果想要消除PCR，可以从大量的起始物质(~5 μg)开始，以产生与标准方案相同的产量。请注意，至少需要一个PCR循环才能打开叉形适配器。

是的。要在没有控制的情况下运行协议，在每个步骤中用respension Buffer (RSB)代替控制混合物。详细信息请参阅适当的TruSeq DNA或RNA样品制备指南。

对中的备用分段协议部分TruSeq RNA样品制备v2指南(文档# 15026495)描述用于更改库的插入大小的下列选项:

• 修改分片时间。
• 合成双链cDNA后剪切样品。

DSN规范化协议针对truseq之前的库进行了优化。TruSeq RNA库不容易接受深氮处理。主要有两个问题:

• 洗脱-引物-片段混合物对非poly(A) RNA不优化。
• 对TruSeq RNA的引物进行了优化，获得了较高的产量。由于DSN具有双特异性核酸酶活性，因此其产量要低得多，所以PCR引物不能有效地扩增经过DSN处理的TruSeq RNA库。

使用较大的片段大小是可能的，但是，我们发现较短的片段大小产生最好的覆盖。有关更多信息，请参阅您正在使用的TruSeq RNA库准备套件的用户指南中的附录A。

在汇集样本之前，应该对样本进行量化。如果所有DNA样本的质量相似，则可以在汇集后进行量化，但这需要非常一致的产量，不应该由新用户尝试。详情请参阅适当的库准备指南。

如果汇集比工具包中提供的索引数目少，则需要考虑低丛度索引组合。在索引读取期间需要颜色平衡，以确保正确的图像配准。如果在索引读取的一个颜色通道（红色或绿色）中没有信号，则图像配准可能会失败，并且不会为该循环调用任何基。如果未调用base，则读取的索引可能无法与样本表中指定的序列匹配，然后样本将无法解复用。参考索引适配器池指南为Illumina测序系统提供建议和指南，这些系统需要平衡的指数组合。如果索引组合不满足这个要求，Illumina实验经理(IEM)在生成样本表时给出警告。

是的，只要使用索引读引物和多重读引物。TruSeq DNA和RNA库的结构和引物附着位点与v2多路库相同。

Illumina不支持在流单元的同一车道上运行由不同库准备套件准备的库。这种做法可能会影响集群密度、数据分布和运行质量。

对于在HiSeq系统上运行，在运行开始时创建和加载一个样本表是可选的。但是，使用样例工作表允许您在运行期间查看测序分析查看器(SAV)中的索引选项卡上显示的数据。如果在HCS中开始运行时未加载样例表，则无法在SAV中查看索引数据。

如果您正在MiSeq控制软件中设置运行或使用CASAVA v1.8.2分析索引样本，则需要样本表。

Illumina建议您在进行库准备之前使用Illumina实验管理器(IEM)创建样本表，以确定适当的索引组合。

不。要启用多路复用，请指定正确的使用基础掩码并使用适当的样本表。

该数据可与TruSeq RNA Library Prep v2数据相比较。TruSeq strand mRNA和Directional mRNA- seq协议基于不同的连接化学反应，因此产生的文库也会有所不同。对于这些库类型，不建议进行直接的样本间比较。